ROS induced distribution of mitochondria to filopodia by Myo19 depends on a class specific tryptophan in the motor domain

doi:10.1038/s41598-017-11002-9

.2017年9月14日；7(1):11577.

doi:10.1038/s41598-017-11002-9。

ROS诱导的线粒体通过Myo19向丝状足的分布依赖于运动域中的一类特异色氨酸

鲍里斯·施耐尔¹, 马尔科·乌沙吉¹, Naama Wiesel动机¹, 罗尼特·雷格夫¹, 阿诺·海恩²

附属公司

¹Technion以色列理工学院生物学院，以色列海法，3200003。
²Technion以色列理工学院生物学院，以色列海法，3200003。arnon.henn@technion.ac.il。

PMID： 28912530
预防性维修识别码：项目编号：C5599611
内政部： 10.1038/s41598-017-11002-9

ROS诱导的线粒体通过Myo19向丝状足的分布依赖于运动域中的一类特异色氨酸

鲍里斯·施耐尔等。科学代表. 2017.

.2017年9月14日；7(1):11577.

doi:10.1038/s41598-017-11002-9。

作者

鲍里斯·施耐尔¹, 马尔科·乌沙吉¹, Naama Wiesel-Motiuk公司¹, 罗尼特·雷格夫¹, 阿诺·海恩²

附属公司

¹Technion以色列理工学院生物学院，以色列海法，3200003。
²Technion以色列理工学院生物学院，以色列海法，3200003。arnon.henn@technion.ac.il。

PMID： 28912530
预防性维修识别码：项目编号：C5599611
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摘要

肌动蛋白细胞骨架在线粒体功能和动力学方面的作用最近才开始被认识。Myo19是一种以肌动蛋白为基础的运动，与线粒体外膜结合，在葡萄糖饥饿时促进线粒体定位于丝足类。然而，葡萄糖饥饿如何诱导线粒体定位到丝状伪足，这一过程的动力学是什么，以及哪些酶适应允许线粒体移位到丝状假足尚不清楚。在这里，我们发现活性氧（ROS）模拟并介导葡萄糖饥饿诱导的表型。此外，延时荧光显微镜显示，ROS诱导的Myo19运动是一个高度动态的过程，与丝状体伸长和收缩相耦合。有趣的是，运动域中XIX类肌球蛋白独特残基的连续一致突变抑制了Myo19的运动。纯化突变体Myo19运动结构域的动力学分析表明，与WT运动结构域相比，占空比（与肌动蛋白紧密结合的时间）受到严重损害，这表明Myo19独特的运动特性是推动线粒体向丝足类尖端运动所必需的。总之，我们的研究证明了肌动蛋白为基础的运动通过特定的细胞线索对丝状足类线粒体定位的贡献。

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作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
葡萄糖饥饿诱导丝状伪足形成是由活性氧介导的。(一)左图：通过向饥饿培养基中补充抗氧化剂，可以抑制葡萄糖饥饿诱导的Filopodia。emLifeact（荧光标记肌动蛋白结合蛋白）在U2OS细胞中瞬时表达，以可视化肌动蛋白和丝状伪足。然后将细胞置于饥饿培养基中，不添加任何补充物或添加过氧化氢酶（60 µg/ml），没食子酸丙酯（PG，20 µM）或两者的组合（EtOH用作载体）。右侧面板：ROS诱导丝状伪足形成。emLifeact表达的U2OS细胞暴露于PG或0.2 毫米高₂O（运行）₂在完全生长培养基中诱导丝状伪足形成2小时。注意，与饥饿培养基相比，完整培养基中PG的作用不足。酒吧是20 微米。(b条)丝状伪足数量和长度的量化(一). 从三个独立的实验中，对每种情况人工计数超过300个丝状伪足。通过双尾Student T检验评估丝状伪足数量和长度变化的显著性。每个细胞的丝状体数pVal = 1.4 × 10⁻⁶, 0.083, 0.0001, 3.91 × 10⁻¹¹, 3.57 × 10⁻¹¹，0.4.pVal用于丝孔长度 = 1.27 × 10⁻¹⁴、0.01、0.093、0.0027、0.0035、0.161（顺序与图表相同）。(**c（c）**)H内源性Myo19的免疫荧光₂O（运行）₂受刺激的U2OS细胞显示，它定位于丝状体顶端的线粒体。蓝色-细胞核，绿色-αMyo19，红色-卵磷脂染色肌动蛋白，洋红色-线粒体标记物ATP5A（ATP-合成酶亚基-α）。条形图为10 微米。Zoom–黄色矩形所示区域的放大倍数。我们注意到，ATP5A的染色也是核染色，但这是由于用于检测ATP5A染色的二级抗体，即使在没有ATP5A抗体的情况下，也会染色细胞核。

图2
Myo19选择性地定位于丝状伪足的一个子集。用红宝石标记的Myo19和GFP标记的Myo20或GFP标记mDia2ΔDAD（mDia2组成活性形式）共同转染U2OS细胞，诱导丝状伪足形成。Myo10和mDia2ΔDAD表达细胞均表现出多丝状伪足，而Myo19仅定位于mDia2△DAD诱导的丝状伪满尖端。蓝色-细胞核，绿色-Myo10或mDia2ΔDAD，红色-红宝石标记的Myo19，洋红-指骨蛋白染色的肌动蛋白。条形图为10 微米。

图3
emMyo19定位到丝状伪足尖端的动力学。延时电影中荧光显微镜图像的蒙太奇图，揭示了emMyo19运动的动态性质，并在0.2后定位到丝足类动物的尖端和回到细胞体毫米高₂O（运行）₂刺激。(一)emMyo19对丝足类尖端的顺行运动(b条)emMyo19向细胞体的逆向运动。每个面板下都显示了装箱区域的Kymograph。绿色–emMyo19，红色–Ruby-Lifeact。条形图为10 微米。

图4
W140是Myo19运动结构域中的一个保守残基，对丝状足类尖端定位至关重要。(一)Swiss-Prot中保存的人类肌球蛋白序列的序列比对显示，存在一种独特的色氨酸，而不是共识的缬氨酸或谷氨酸，几乎所有Myo19同源物中都保留了这种独特的色胺酸（38/39）。(b条)基于同源性的Myo19（青色）和Myo19结构预测^宽140伏（tan）通过Phyre2服务器，与两个解析的人类Myo5结构（未显示，RCSB:4ZG4，1W7J）对齐，并在P-Loop中绑定ADP（显示）。(**c（c）**)Halo标记的Myo19或Myo19的共放大^宽140伏线粒体染色的突变体，MitoTracker Green-FM。从黄线生成的强度图显示，突变体定位于线粒体类似于野生型。酒吧是20 微米。蓝色–细胞核，绿色–线粒体MitoTracker绿色-FM染色，红色–Halo标记的Myo19或Myo19^宽140伏. (d日)H（H）₂O（运行）₂刺激过度表达Halo标记Myo19或Myo19的U2OS细胞^宽140伏导致Myo19定位于丝状伪足尖端，而不是Myo19^宽140伏.Bar为20 微米。缩放-黄色矩形所示区域的放大倍数。线粒体的缺失是由于它们位于较高的焦平面，而这些丝足类形成于细胞的底部。微弱的弥散信号很可能是由线粒体Myo19过度表达或饱和引起的。蓝色-细胞核，绿色-emLifeAct，红色-Halo标记的Myo19或Myo19^宽140伏. (**e（电子）**)Myo19的营救^宽140伏WT Myo19的突变表型。U2OS细胞与Halo标记的Myo19联合转染^宽140伏和WT emMyo19或eGFP对照，并用H诱导₂O（运行）₂如前所示，Myo19^宽140伏无法够到丝状伪足的尖端。令我们惊讶的是，Myo19能够修复定位缺陷，并促进了突变体对丝状伪足尖端的定位。蓝色–细胞核，绿色–GFP或emMyo19，红色–Halo标记的Myo19^宽140伏，洋红-指骨蛋白染色肌动蛋白。条形图为10 微米。

图5
肌动蛋白激活的稳态ATP酶活性显示Myo19-3IQ的改变^宽140伏酶学。Myo19-3IQ（WT）和Myo19-3 IQ的肌动蛋白丝浓度依赖性^宽140伏（W140V）稳态ATP酶活性。穿过数据点的实线最适合矩形双曲线( $v（v） = {v（v）}_{0 +} ({k个}_{c（c）一 t吨} [一 c（c） t吨我 n个]) / ({K（K）}_{A类吨 P（P）一秒 e（电子）} + [一 c（c） t吨我 n个])$ ). 误差条表示不同蛋白质纯化至少三个独立实验的标准偏差。Myo19-3IQ（WT）的数据转载自（Usaj&Henn，平行提交）。

图6
比较Myo19-3IQ（WT）和Myo19-3 IQ之间关键生化转变的动力学反应方案^宽140伏（W140V）突变。在这个方案中，显示了四个与核苷酸相关的动力学转变：ADP异构化步骤、ADP释放步骤、ATP结合和核苷酸结合囊异构化。表1中也列出了速率常数。WT和W140V是Myo19-3IQ和Myo19-3IQ的缩写^宽140伏突变体。

图7
ATP与Acto·Myo19的结合^w140伏-3IQ（W140V）显示出与Myo19-3IQ（WT）不同的动力学行为(一). 混合0.25后光散射时间过程减小 0μM肌动球蛋白微米(一), 1.95 (b条), 3.9 (**c（c）**), 7.8 (d日), 62.5 (**e（电子）**)Acto·Myo19的，125（f），µM ATP^宽140伏-3智商。数据为平均瞬态（n = 3–5）。黑线是对双指数函数的最佳拟合（有关拟合残差的分析，请参阅SI）。(b条)混合后光散射减少的时间过程0.25 0μM肌动球蛋白微米(一)或7.8 Acto·Myo19-3IQ的µM ATP^宽140伏(b条)或Acto·Myo19-3IQ(**c（c）**). 数据为平均瞬态（n = 3–5). 数据中的平滑线表示双指数函数的最佳拟合(**c（c）**). [ATP]-ATP与Acto·Myo19-3IQ结合的快速观察速率常数的依赖性^宽140伏与光散射测量的Acto·Myo19-3IQ相比(d日)[ATP]-ATP结合Acto·Myo19-3IQ的慢观察速率常数依赖性^宽140伏与光散射测量的Acto·Myo19-3IQ相比**c（c）**和d日是最适合矩形双曲线的。拟合的误差条在数据点内。(**e（电子）**)快速（A）的比率_快速的)减速（A_缓慢的)Acto·Myo19-3IQ观察到的快速率常数和慢速率常数的振幅作为[ATP]的函数^宽140伏与Acto·Myo19-3IQ相比。Myo19-3IQ（WT）的数据转载自（Usaj&Henn，平行提交）。

图8
ADP分离*Acto·Myo19-3IQ公司* ^宽140伏（W140V）通过与ATP的动力学竞争测量，与*Acto·Myo19-3IQ公司*（重量）。(一)混合0.2后光散射的归一化时间过程减小 µM Acto·Myo19-3IQ^宽140伏使用0 µM ATP（上记录道）或125 存在0至25范围内不同[ADP]时的µM ATP 微米。数据为平均瞬态（n = 3–5). 数据中的平滑线（黑色）表示双指数函数或单指数函数的最佳拟合。(b条)[ADP]-Acto·Myo19-3IQ的观察慢速率常数和Acto·Myo19-3IQ的单个观察速率常数的依赖性^宽140伏以125的动力学竞争来衡量 µM三磷酸腺苷。(**c（c）**)[ADP]-通过拟合所述瞬态获得的慢相归一化振幅的依赖性(一). (d日)[ATP]-Acto·Myo19-3IQ和Acto·Myo19-3IQ的观察速率常数依赖性^宽140伏25饱和[ADP]下光散射测量的离解微米。通过数据点的线(b条,**c（c）**和d日)是矩形双曲线的最佳拟合。配件的误差条在数据点内。Myo19-3IQ（WT）的数据转载自（Usaj&Henn，平行提交）。

图9
Myo19-3IQ（WT）和Myo19 ATP酶活性和占空比的模拟^宽140伏-3IQ（W140V）。(一)Myo19-3IQ和突变Myo19的ATP酶活性的模拟稳态[肌动蛋白]依赖性^宽140伏-3智商。穿过数据点的实线最适合矩形双曲线( $v（v） = {v（v）}_{0 +} ({k个}_{c（c）一 t吨} [一 c（c） t吨我 n个]) / ({K（K）}_{A类吨 P（P）一秒 e（电子）} + [一 c（c） t吨我 n个])$ ). (b条)占空比是[actin]的函数。占空比是根据稳态时间范围内每个[肌动蛋白]的所有生化中间产物分布的总和计算得出的，公式为：占空比 = （强束缚态）/（强束缚状态 + 弱束缚态）。穿过数据点的实线最适合矩形双曲线( $d日 u个 t吨年第页一 t吨我 o（o） = 1 * [一 c（c） t吨我 n个]) / ({K（K）}_{D类 R（右）} + [一 c（c） t吨我 n个])$ ). Myo19-3IQ（WT）的数据转载自（Usaj&Henn，平行提交）。

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