Cavin-2 regulates the activity and stability of endothelial nitric-oxide synthase (eNOS) in angiogenesis

doi:10.1074/jbc.M117.794743

.2017年10月27日；292(43):17760-17776.

doi:10.1074/jbc。M117.794743。 Epub 2017年9月14日。

Cavin-2调节血管生成中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活性和稳定性

附属公司

¹来自新加坡Proteos Biopolis Drive 61号科学技术与研究局分子与细胞生物学研究所（IMCB），gandhibtk@imcb.a-star.edu.sg。
²SERI-IMCB视网膜血管生成性疾病项目（SIPRAD），SERI-IMDB，新加坡。
^三新加坡南洋理工大学李光诚医学院。
⁴来自新加坡Proteos Biopolis Drive 61号科学技术与研究局分子与细胞生物学研究所（IMCB）。
⁵新加坡眼科研究所（SERI），新加坡大学路20号，169856。
⁶新加坡大学路8号杜克美国研究生院眼科和视觉科学学术临床项目，169857。
⁷新加坡国立大学林永禄医学院眼科。
⁸来自新加坡Proteos Biopolis Drive 61号科学技术与研究局分子与细胞生物学研究所（IMCB），mcbhwj@imcb.a-star.edu.sg。

PMID： 28912276
预防性维修识别码： PMC5663877
内政部： 10.1074/jbc。M117.794743号

Cavin-2调节血管生成中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的活性和稳定性

甘地·T·K·博帕蒂等。生物化学杂志. 2017.

.2017年10月27日；292(43):17760-17776.

doi:10.1074/jbc。M117.794743。 Epub 2017年9月14日。

附属公司

¹来自新加坡Proteos Biopolis Drive 61号科学技术与研究局分子与细胞生物学研究所（IMCB），gandhibtk@imcb.a-star.edu.sg。
²SERI-IMCB视网膜血管生成性疾病项目（SIPRAD），SERI-IMDB，新加坡。
^三新加坡南洋理工大学李光诚医学院。
⁴来自新加坡Proteos Biopolis Drive 61号科学技术与研究局分子与细胞生物学研究所（IMCB）。
⁵新加坡眼科研究所（SERI），新加坡大学路20号，169856。
⁶新加坡大学路8号杜克美国研究生院眼科和视觉科学学术临床项目，169857。
⁷新加坡国立大学林永禄医学院眼科。
⁸来自新加坡Proteos Biopolis Drive 61号科学技术与研究局分子与细胞生物学研究所（IMCB），mcbhwj@imcb.a-star.edu.sg。

PMID： 28912276
预防性维修识别码： PMC5663877
内政部： 10.1074/jbc。M117.794743号

摘要

血管生成是一个由先前存在的血管形成新血管的高度调节过程。血管生成在各种病理中失调，包括年龄相关性黄斑变性、关节炎和癌症。因此，抑制病理性血管生成是治疗这些疾病的一种有希望的治疗策略，强调需要更详细地研究血管生成。为此，确定血管形成所必需的基因并阐明其功能对于全面了解血管生成至关重要。在这里，针对血管生成的潜在候选基因，我们对斑马鱼进行了基于吗啉的基因筛查，并确定Cavin-2，一种膜结合磷脂酰丝氨酸结合蛋白和小窝（质膜中的小微域）的关键组织者，作为血管生成的调节器。使用内皮细胞，我们发现Cavin-2对在体外血管生成以及内皮细胞增殖、迁移和侵袭。我们注意到在氧诱导视网膜病变小鼠模型的新生血管簇中Cavin-2的高水平表达，表明Cavin-2在致病性血管生成中发挥作用。有趣的是，我们还发现Cavin-2通过控制内皮一氧化氮合酶（eNOS）的稳定性和活性来调节内皮细胞中一氧化氮（NO）的生成，并且Cavin-2敲除细胞产生的NO比WT细胞少得多。此外，质谱、流式细胞仪和电子显微镜分析表明，Cavin-2分泌于内皮微粒（EMP）中，是EMP生物生成所必需的。综上所述，我们的研究结果表明，Cavin-2除了在小泡的生物发生中发挥作用外，还通过调节eNOS活性在内皮细胞的维持和功能中发挥关键作用。

关键词：血管生成；细胞生物学；eNOS；一氧化氮；一氧化氮合酶；信号转导；斑马鱼。

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数字

**图1。**
**筛选新的血管生成调节剂。** A类，筛选新的血管生成调节基因的工作流程。B，共聚焦显微镜下显微注射候选基因特异性吗啉*裂缝14a*(*氯代14a-mo1*),瑞克(*ryk-mo1型*和*ryk-mo2型*),*时间43*(*时间43-mo1*和*tmem43-mo2*),*TMEM59型*(*时间59-mo1*和*tmem59-mo2*),*IL7R（IL7R）*(*il7r-mo1型*和*il7r-mo2*),*SDPR公司*(*sdpra-mo1型*和*sdpra-mo2*),*TINAGL1公司*(*tinagl1-mo1*和*视黄醛-1-甲氧基*)Tg中的吗啉基因及其调控(*飞行1a*：eGFP）^y1个受精后24小时的胚胎。Tg体间血管的EGFP信号(*飞行1a*：eGFP）^y1个用共焦显微镜记录，并显示代表性图像。比例：100微米。

**图2。**
**确定Cavin-2是一种新的血管生成调节剂。** A类Tg的共焦显微镜图像(*飞行1a*：eGFP）^y1个微注射Cavin-2基因特异性吗啉的胚胎(*sdpra-mo1型*和*sdpra-mo2*)或控制吗啉。顶行表示差分干涉对比度(*DIC公司*)图像，*中间一排*表示来自Tg的EGFP信号(*飞行1a*：eGFP）^y1个、和*最下面一行*代表*缩放插入*来自的图像*中间一排*所示EGFP面板来自图1所示的吗啉屏幕B并在这里表示，在变体和对照之间没有主要的表型差异，并详细观察Cavin-2变体相对于对照变体的体间血管缺陷。比例，1毫米。BHAEC、HUVEC和HPMEC细胞WCL上α-Cavin-2和α-β-actin抗体的免疫印迹显示Cavin-2的表达较高。β-肌动蛋白作为负荷控制。C类OIR后P17小鼠视网膜CD31和Cavin-2免疫荧光染色。新生血管簇处Cavin-2表达丰富(*白色箭头*)而低本构表达与周围非变异血管有关(*黄色箭头*).比例，20微米。D类，在发育中的小鼠视网膜中，Cavin-2mRNA表达的增加与血管密度的增加有关。采用Tukey多重比较检验进行单因素方差分析。数据表示为平均值±S.D(n个≥3只动物）；*，第页< 0.05.E类Cavin-2的免疫荧光染色表明，P7小鼠幼崽的视网膜血管组织中存在低组成和均匀表达，而P21成熟视网膜血管组织的表达水平较低。比例，20微米。

**图3。**
**Cavin-2是HUVEC细胞增殖、迁移和侵袭所必需的。** *A、，*非靶向对照敲除后HUVEC WCL的Western blot分析(*siControl（siControl）*)或cavin-2(*siCavin-2型*)使用siRNAs显示Cavin-2表达严重缺失。β-肌动蛋白作为负荷控制。B使用MTT分析法对上述时间点的siControl和siCavin-2 HUVEC进行细胞增殖分析，结果显示siCavin-2HUVECs的细胞增殖有缺陷。C类使用伤口愈合测定法分析对照和Cavin-2敲低的HUVEC细胞的细胞迁移。所示细胞在0和16小时的划痕后照片显示，Cavin-2缺失后细胞迁移有缺陷。D类，在划伤后16小时使用ImageJ对伤口闭合面积进行量化。E类培养12小时后，使用对照组和Cavin-2敲除HUEVC，使用跨阱迁移室（8微米孔径）分析细胞迁移，发现sicavin-2 HUEVC的细胞迁移有缺陷。F类，使用ImageJ对迁移12 h后迁移的结晶紫染色内皮细胞进行量化。*G公司*，Matrigel侵入对照组和Cavin-2在48小时后使用Boyden小室试验击倒HUVEC表明Cavin-2的丢失严重影响HUVECs的侵袭潜能。细胞在4%多聚甲醛中固定，并用结晶紫染色。*H（H）*，使用ImageJ对通过Matrigel涂层过滤器的细胞侵袭进行量化。图表中的结果是三个独立实验的平均值±S.D.。*表示第页< 0.05.

**图4。**
**Cavin-2缺失抑制血管生成*在体外*在多个内皮细胞中。**Matrigel酒店*在体外*对照组击倒后进行试管形成分析(*si-控制*)和Cavin-2击倒(*siCavin-2型*)在以下内皮细胞中：A类、HAEC。C类、HUVEC。E类，HPMEC。*G公司*、HRMVEC。大约5000-7000个带有内皮细胞生长介质的细胞被镀在Matrigel基底膜基质上，形成管状结构，并使用尼康显微镜进行记录。这个图表示支路数量和总网络长度的平均值±S.D.的量化*在体外*试管形成分析：B、HAEC；D类HUVEC；F类HPMEC；和*H（H）*，HRMVEC使用ImageJ计算。*表示第页< 0.05.

**图5。**
**验证HUVEC中Cavin-2敲除的特异性。**用单个siRNAs（编号5、6、7和8）击倒HUVEC细胞对抗Cavin-2(*siCavin-2型*)和非目标控制(*siControl（siControl）*).A类Western blot分析Cavin-2和β-肌动蛋白的WCL。6号和7号siRNA中Cavin-2蛋白表达严重缺失。β-肌动蛋白作为负荷控制。B,*在体外*在HUVEC中对对照组和两个单独的Cavin-2 siRNAs（编号6和7）进行的血管生成试验表明，在失去Cavin-2后，导管形成有缺陷。C类，图表示使用三个独立实验的ImageJ计算的HUVEC中分支数和总网络长度的平均值±S.D.的量化。*，表示第页< 0.05.

**图6。**
**Cavin-2控制eNOS的活性和稳定性。** A类在SDS-PAGE中分离对照组（siControl）和Cavin-2（siCavin-2）敲除的HUVEC的WCL，并对α-eNOS、α-Cavin-2和α-β-Actin抗体进行免疫印迹。B将siControl和siCavin-2 HUVEC与不含补充生长因子的内皮细胞生长培养基孵育10–12小时，用VEGF刺激以激活eNOS，并在上述时间点收获。收集细胞的WCL进行α-磷酸-eNOS免疫印迹(*第1177页*)、α-eNOS、Thr-202/Tyr-204α-磷酸-p44/42 MAPK（pERK）、α-p44/42-MAPK（Erk）、α-Cavin-2和α-β-肌动蛋白抗体。β-肌动蛋白作为负荷控制。C类和D类，基于密度计的磷酸-eNOS定量(*第1177页*) (C类)和总eNOS(D类)使用ImageJ从两个独立实验中对上述时间点进行归一化为β-肌动蛋白染色。E类在二甲基亚砜处理的血管内皮生长因子激活后，DAF-2（一种细胞渗透性荧光NO指示剂）的实时成像，我-NAME处理、siControl和siCavin-2 HUVEC。使用共聚焦显微镜记录所发射的荧光，并且在我-NAME处理和siCavin-2 HUVEC。F类，经二甲基亚砜处理的DAF-2处理后的荧光信号强度，我-使用ImageJ从至少三个独立实验中对NAME处理的、siControl和siCavin-2 HUVEC进行量化。*G公司*，HUVEC转染GFP或Cavin2-GFP质粒，与不添加生长因子的内皮细胞生长培养基孵育12 h，用或不用VEGF刺激，收获，并进行α-磷酸化-一氧化氮合酶免疫印迹(*第1177页*)α-总eNOS、α-GFP、α-Caveolin-1和α-β-肌动蛋白抗体。*比例尺*，10微米*表示第页< 0.05.

**图7。**
**Cavin-2对eNOS的调节不需要Caveolae。** A类和B、HUVEC(A类)和HRMVEC(B)被控制住了(*siControl（siControl）*)，鱼子酱-2(*siCavin-2型*)和Caveolin-1(*siCaveolin-1*)使用特定的siRNA。细胞在不含补充生长因子的内皮细胞生长培养基中孵育12 h，用VEGF刺激，15 min后收获，并对α-磷酸化-一氧化氮合酶进行免疫印迹(*第1177页*)、α总eNOS、αCavin2、αCaveolin-1和α-β-Actin抗体。C类和D类，人脐静脉内皮细胞上Cavein-2和Caveolin-1的免疫荧光分析(C类)和HRMVEC(D类)siControl、siCavin-2和siCaveolin-1之后。质膜上小窝蛋白-1的连续染色是小窝形成的特征，DAPI染色代表细胞核。E类、异位表达和免疫沉淀(*IP（IP）*)HPMEC-ST1.6R细胞中Cavin-2的表达。Cavin-2-GFP或GFP质粒在HPMEC-ST1.6R中表达，WCL用于IP。对WCL和IP进行eNOS、Caveolin-1和GFP抗体的免疫印迹。*比例尺*，10微米。

**图8。**
**Cavin-2控制eNOS的细胞定位。** A类α-eNOS抗体的免疫荧光(*siControl（siControl）*)和Cavin-2(*siCavin-2*)击倒HUVEC。DAPI染色代表细胞核。B从等量的siControl和siCavin-2 HUVEC分离的总膜上的eNOS和CD31免疫印迹。在SDS-PAGE上，未经处理的HUVEC的总膜与WCL一起溶解，并转移到硝化纤维素膜上。上右侧siControl和siCavin-2 HUVEC的WCL与α-Cavin-2和α-β-肌动蛋白抗体的免疫印迹。β-肌动蛋白作为负荷控制。C类，Cavin-2调节内皮细胞NO生成的方案。Cavin-2的存在通过稳定和激活eNOS积极帮助NO的生成。Cavin-2的缺失通过破坏eNOS的稳定性和失活对NO的生成产生不利影响。*比例尺*，10微米。

**图9。**
**Cavin-2在EMP中分泌。** A类收集HUVEC条件培养基，分离外泌体和EMP，与WCL一起在SDS-PAGE中分离，并用免疫印迹法检测外泌体内是否存在Cavin-2(*TSG101型*)，微粒(*CD31型*)和胞浆（β-*管蛋白*). 使用纳米空白聚苯乙烯珠作为流式细胞术中的参考，将分离的EMP分选为0.1至1μm大小的颗粒。分析EMP与内皮细胞表面标记物共同染色Cavin-2，B和C类、VE-卡德林(B)和CD31(C类). α-Cavin-2抗体与AMCA偶联，α-VE-卡德林和α-CD31抗体均用PE偶联。D类用α-Cavin-2抗体定位Cavin-2在EMPs上，然后用山羊α-兔二级抗体与10-nm金偶联，并用透射电镜进行分析。显示了来自独立实验的两张代表性图像。*比例尺*，100纳米。E类从相同数量的对照（siControl）和Cavin-2（siCavin-2）敲除HUVEC中分离和浓缩EMP。分离的EMP与siControl和siCavin-2细胞的WCL在SDS-PAGE中分离，转移到硝化纤维素膜上，并使用0.1%Ponceau S染色试剂染色。用Ponceau S染色siControl和siCavin-2 HUVEC分泌的EMPs的总蛋白丰度用ImageJ定量，信号强度由三个独立的实验绘制(*美国。，*任意单位）。F类用α-Cavin-2、α-CD31和α-β-Tubulin抗体对来自siControl和siCavin-2 HUVEC的EMP和WCL进行免疫印迹。

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