PI3K-C2α knockdown decreases autophagy and maturation of endocytic vesicles

doi:10.1371/journal.pone.0184909

.2017年9月14日；12（9）：e0184909。

doi:10.1371/journal.pone.0184909。 2017年电子收集。

PI3K-C2α基因敲除降低内吞小泡的自噬和成熟

内森·梅里尔^1 2, 约书亚·L·希珀², 乔纳森·卡恩斯^1 2, 奥德拉·考夫曼², 凯蒂·R·马丁², 杰弗里·麦凯根（Jeffrey P MacKeigan）^1 2 三

附属机构

¹美利坚合众国密歇根州大急流城Van Andel研究所研究生院。
²美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症细胞生物学中心。
^三美国密歇根州大急流城密歇根州立大学人类医学院。

采购管理信息： 28910396
PMCID公司：项目编号：C5599018
内政部： 10.1371/journal.pone.0184909

PI3K-C2α基因敲除降低内吞小泡的自噬和成熟

内森·梅里尔等。公共科学图书馆一号. 2017.

.2017年9月14日；12（9）：e0184909。

doi:10.1371/journal.pone.0184909。 2017年电子收集。

作者

内森·梅里尔^1 2, 约书亚·L·希佩尔², 乔纳森·卡恩斯^1 2, 奥德拉·考夫曼², 凯蒂·R·马丁², 杰弗里·麦凯根（Jeffrey P MacKeigan）^1 2 三

附属机构

¹美利坚合众国密歇根州大急流城Van Andel研究所研究生院。
²美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所癌症细胞生物学中心。
^三美国密歇根州大急流城密歇根州立大学人类医学院。

采购管理信息： 28910396
PMCID公司：项目编号：C5599018
内政部： 10.1371/journal.pone.0184909

摘要

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）家族成员参与多种细胞命运，包括细胞生长、增殖和存活。虽然对I类和III类PI3K的许多分子细节是已知的，但对II类PI3K的了解较少。为了探索所有八种PI3K亚型在自噬中的功能，我们分别敲除每个基因并测量自噬。我们发现，在siRNA-介导的PIK3C2A（编码2类PI3K，PI3K-C2α）敲除后，自噬显著减少。这种有缺陷的自噬被外源性PI3K-C2α挽救，而不是激酶缺失的PI3K-C1α。利用共焦显微镜，我们探测了内吞和自噬标记，发现PI3K-C2α与内吞标记共定位。尽管内吞摄取是完整的，如转铁蛋白标记所示，PIK3C2A敲除导致循环内体中的小泡堆积。我们分离出不同的膜源，观察到PI3K-C2α与内吞和自噬标记物相互作用，尤其是ATG9。敲除PIK3C2A或ATG9A/B，但不敲除PI3KC3，会导致转铁蛋白阳性的网格蛋白包衣囊泡和RAB11阳性的囊泡在再循环内体中积聚。总之，这些结果支持PI3K-C2α在内胚体适当成熟中的作用，并提示PI3K-C2-α可能是连接内吞和自噬途径的关键节点。

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利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。PI3K-C2α敲除降低自噬。**
用针对八种PI3K亚型的siRNA转染稳定表达ptfLC3B的（A-E）U2OS细胞48小时。用60倍油物镜通过荧光显微镜对细胞成像。比例尺代表10μm。（A）使用对照siRNA，用载体或雷帕霉素处理细胞6小时以诱导自噬。针对I类PI3K亚型的（B-D）siRNAPIK3CA公司,*PIK3CB型*,*猪3CG*,*PIK3CD公司*（B），*PIK3C2B型*或*PIK3C2G系列*（C）、和*PIK3C2A系列*或*PIK3C3型*（D）雷帕霉素处理6小时。（E）定量（A-D）中每个细胞自噬点的数量。数据表示n≥25个单元格的平均值，平均值的标准误差。未付款t吨试验，实验与雷帕霉素对照*表示p<0.05，***表示p<0.001。

**图2。PI3K-C2α是自噬的阳性调节因子。**
（A-D）绘制了BafA1存在（浅灰色圆圈）或不存在（深灰色圆环）时累积的GFP-LC3-II点的数量（t=0到t=70分钟）。纵轴上的值表示调整后的平均穿孔数，以便t=0时的值为0。通过减去t=0时的平均小泡数来调整平均值。（A）溶媒处理的对照siRNA细胞，以及（B）雷帕霉素在时间t=0添加雷帕霉素后，在对照siRNA条件下诱导自噬。（C，D）*PIK3C2A系列*siRNA敲除（48小时）和用载体对照（C）或雷帕霉素（D）处理的细胞。条形图表示标准偏差。

**图3。PI3K-C2α敲除抑制持续的自噬并导致脂滴的形成。**
（A）用siRNA转染稳定表达ptfLC3B的U2OS细胞*PIK3C2A系列*,*PIK3C3型*、和*ULK1型*48小时。在添加雷帕霉素（50 nM）后连续6小时进行肝细胞成像，以测量GFP-LC3点状积聚的变化。（B）将siRNA转染U2OS细胞*PIK3C2A系列*,*PIK3C3型*、和*ULK1型*48小时，然后用雷帕霉素治疗（6小时），在没有或存在BafA1的情况下诱导自噬（90分钟）。检测ATG8亚型（LC3A、LC3B和GABARAP）和p62（SQSTM1）以检测自噬的变化。（C）用siRNA转染稳定表达EGFP-LC3B的U2OS细胞*PIK3C2A系列*48小时。24小时后，转染siRNA-resistant野生型蛋白（WT-PI3K-C2α）或siRNA-resistant激酶死亡蛋白（KD-PI3K-C2α）。在额外的24小时后，用雷帕霉素处理细胞6小时，并从外源性PI3K-C2α表达细胞中计算每个细胞的点状细胞数。代表性图像如S3图所示。数据表示n≥25个细胞的平均值，平均值的标准误差。未付款t吨测试，对比实验和控制***表示p＜0.001。（D）通过透射电子显微镜测量，PI3K-C2α的缺失会增加脂滴（LD）。插图为5倍放大倍数。

**图4。PI3K-C2α与早期内吞标记物共定位。**
将表达mCherry-PI3K-C2α的U2OS细胞系固定，并用抗甲氰菊酯（A）、EEA1（B）、RAB5（C）、RAB11（D）、LC3B（E）和LAMP2（F）的一级抗体染色。二级抗体（绿色）标记一级抗体染色。用60×油物镜通过共聚焦显微镜对细胞进行成像。盒子是插图的5倍放大倍数。比例尺10μm。

**图5。PI3K-C2α洗脱并与内吞和自噬标记物相互作用。**
（A）从差速离心（见图S6）和OptiPrep梯度颗粒（第5和第6组分）中提取的U2OS组分（P2、P3和S3）用于检测内吞和自噬标记。（B）从293FT细胞和检测内吞和自噬标记物的裂解物中免疫沉淀V5-PI3K-C2α或V5-PI3G-C3。（C）野生型（WT）或激酶-Dead[64]V5-PI3K-C2α从293FT细胞和检测内吞和自噬标记物的裂解物中免疫沉淀。（B，C）以所示抗体作为对照，检测全细胞裂解物（WCL）。

**图6。PI3K-C2α或ATG9敲除导致转铁蛋白在再循环内体中积累。**
U2OS细胞转染对照siRNA或直接转染*PIK3C2A系列*,*ATG9A/B型*,*或PIK3C3*48小时。雷帕霉素处理（6小时）后，将细胞与德克萨斯红结合的转铁蛋白一起孵育，用新鲜培养基洗涤，并返回37°C。用内源性氯氰菊酯（A）、EEA1（B）和RAB11（C）抗体对细胞进行染色。二级抗体（绿色）标记一级抗体染色。使用共焦显微镜和60倍油物镜对细胞成像。比例尺显示10μm。（D）内源性蛋白质与德克萨斯州红转铁蛋白囊泡共定位的百分比。未付款t吨试验对比实验和控制*表示p<0.05，***表示p<0.001。

**图7。提出了PI3K-C2α如何促进内吞膜源通过再循环内体整合到自噬途径的模型。**
模型突出了PI3K-C2α在内吞和自噬途径中的定位。缩写：CCP：氯氰菊酯涂层坑；EE：早期内体；LE：晚期内体；MVB：多泡体；回复：回收内体。

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1. Beaulaton J，Lockshin RA（1977年），对多裂棘鲷和六翅目（昆虫纲，鳞翅目）节段间肌肉正常退化的超微结构研究，特别是细胞自噬。形态学杂志154:39–57。数字对象标识：1002540104年10月10日-内政部-公共医学
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