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.2017年5月22日；8(33):54735-54746.
doi:10.18632/目标18047。 eCollection 2017年8月15日。

AGO2参与下咽衍生FaDu细胞的恶性表型和FAK/PI3K/AKT信号通路

张燕辉 1, 王宝欣 2, 陈新伟（Xinwei Chen） 2, 李伟东 三, Pin Dong公司 2
附属公司

AGO2参与下咽衍生FaDu细胞的恶性表型和FAK/PI3K/AKT信号通路

张燕辉等。 肿瘤靶点. .

摘要

精氨酸2（AGO2）蛋白通常在各种头颈部鳞状细胞癌中过度表达。然而，AGO2在下咽癌中的确切分子机制尚不清楚。我们发现，与相应的邻近非癌上皮组织相比，下咽癌组织中AGO2的表达普遍较高，这与更具侵袭性的临床病理特征和较差的临床结果有关。AGO2蛋白的稳定敲除可延缓细胞增殖、迁移、侵袭、阻滞细胞周期和诱导凋亡。同时，敲除也抑制了下咽衍生FaDu细胞中的FAK/PI3K/AKT信号通路。这些发现表明AGO2公司基因可能作为一种癌基因参与肿瘤的发生和发展，对下咽癌的分子诊断、临床治疗和预后评估具有潜在价值。

关键词：AGO2；FAK/PI3K/AKT信号通路；细胞增殖；下咽癌。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1。AGO2在HPSCC中的表达
（A）通过IHC获得HPSCC和相邻非癌上皮标本（n=56）中AGO2表达的代表性图像。AGO2在HPSCC（左侧为肿瘤组织）、弥漫性细胞质和部分核染色中呈阳性表达，特别是在巢状边缘，中心有粉红色角蛋白。相邻非癌上皮中AGO2表达较弱（右侧正常组织）。（B、C、D）采集15例HPSCC患者（肿瘤组织）和15例悬雍垂腭咽成形术患者（正常组织）正常上皮粘膜组织的AGO2 mRNA和蛋白表达数据。AGO2 mRNA的表达水平分别归一化为GAPDH。AGO2蛋白表达水平是通过使用ImageJ软件对比每个带的灰度来计算的。直方图表示AGO2蛋白的表达水平，并将其归一化为β-肌动蛋白。误差条代表三个独立实验的平均值±标准差。（E）根据AGO2的表达水平，Kaplan-Meier曲线代表HPSCC患者的生存率（AGO2+，≥3分；AGO2-，<3分）。蓝色，AGO2阴性表达患者（n=17，3年生存率88.24%）；绿色，AGO2阳性表达患者（n=39，3年生存率56.41%；log-rank检验，P（P）=0.03).
图2
图2。AGO2敲除对FaDu细胞的抑制作用在体外和体内
（A）通过实时RT-PCR和western blotting分析测定了与对照组相比，被慢shRNAs（RNAi#1和RNAi#2）显著抑制的AGO2 mRNA和蛋白的表达水平。AGO2 mRNA的表达水平归一化为GAPDH。通过使用ImageJ软件比较每个带的灰度来确定蛋白质数量，并将其归一化为对照组。（B）在CCK-8实验中，稳定的转导细胞的增殖能力随时间明显受到抑制。（C）左侧面板显示菌落的晶体染色。直方图（右侧）表示形成的菌落数量。（D）左侧显示接种4周后肿瘤形成。右侧面板显示了增长曲线。（E、F）代表性图片显示细胞迁移和侵入（左面板，250μm）。直方图（右侧面板）表示细胞迁移和侵袭的百分比，并与对照组标准化*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001.
图3
图3。流式细胞术检测AGO2敲除对稳定转导FaDu细胞的细胞周期和凋亡的影响
（A）代表性图表显示了细胞周期的分布。与对照组相比，AGO2敲除使细胞周期阻滞在G2/M期。（B）Annexin-V PE/7-AAD染色的代表性流式细胞术散射图显示了活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的分布。Q1（附录-V PE-/7-AAD公司+)，Q2（附录-V PE+/7年一遇+)，Q3（附录-V PE+/7-AAD公司-)和Q4（附录-V PE-/7-AAD公司-)分别代表坏死细胞、晚期凋亡和坏死细胞、早期凋亡细胞和存活细胞。（C）直方图表示G1/G0、S和G2/M期细胞的百分比。（D）直方图显示了AGO2击倒细胞和对照细胞凋亡百分比的定量结果。（E）直方图左侧显示晚期凋亡和坏死细胞的百分比，而直方图右侧是早期凋亡细胞的百分比(P（P）=0.0673）*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001.
图4
图4。IHC的代表性图片反映了Ki-67、裂解Caspase-3和E-cadherin在人类下咽肿瘤标本和异种移植物中的表达
（A1）HPSCC中的Ki-67，（A2）Ki-67在邻近的非癌上皮中，（B1）HPSCC中裂解的Caspase-3，（B2）在邻近的非癌上皮中裂解Caspase-3，（C1）HPSCC中的E-cadherin，（C2）邻近非癌上皮中的E-钙粘蛋白，（D1）RNAi#1异种移植物中的Ki-67，（D2）RNAi#2异种移植物中的Ki-67，（D3）Scramble异种移植物中的Ki-67，（E1）RNAi#1异种移植物中裂解的Caspase-3，（E2）RNAi#2异种移植物中裂解的Caspase-3，（E3）Scramble异种移植物中裂解的Caspase-3，（一层）RNAi#1异种移植物中的E-cadherin，（二层）RNAi#2异种移植物中的E-cadherin，（三层）Scramble异种移植物中的E-cadherin。比例尺=250μm。
图5
图5。AGO2敲低抑制稳定转导的FaDu细胞中的FAK/PI3K/AKT通路
（A）p-FAK在HPSCC（肿瘤组织）和邻近非癌上皮（正常组织）中的表达水平。（B）直方图显示了p-FAK的相对表达水平。（C）稳定转导FaDu细胞中FAK/PI3K/AKT通路主要蛋白的表达。（D）敲除AGO2可抑制p-FAK的表达和PI3K/AKT信号通路的活性*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001, ****P（P）<0.0001.
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