跳到主页面内容
美国国旗

美国政府的官方网站

Dot政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息，确保你在联邦政府政府网站。

Https公司

该站点是安全的。
这个https（https）：//确保您连接到官方网站，并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2017年8月；26(8):1365-1379.
doi:10.1177/0963689717720282。

利用人诱导多能干细胞内皮细胞构建PDMS网络中的微血管

阿莫·西瓦拉帕塔纳 1, 马布贝·加迪 2, 杨晓 1, 爱德华·韩 1, 比诺德·阿里亚尔 三, 荆州 1, 卡洛斯·费尔南德斯·赫南多 三, 宜宾-曲阳 4, 凯伦·赫斯基（Karen K Hirschi） 4, 劳拉·尼古拉森 1 2
附属公司

利用人诱导多能干细胞内皮细胞构建PDMS网络中的微血管

阿莫·西瓦拉帕塔纳等。 细胞移植. 2017年8月.

摘要

在这项研究中，我们使用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的平台在体外生成完整的灌注兼容微血管网络。COMSOL Multiphysics是一个有限元分析和模拟软件包，用于获得模拟的速度、压力和剪切应力剖面。在完全化学限定的条件下，在5天内将不含转基因的人诱导多能干细胞（hiPSC）分化为部分动脉化的内皮细胞（hiPSC EC），使用小分子糖原合成酶激酶3β抑制剂CHIR99021，并对其功能和动脉样标记表达进行了彻底表征。这些细胞与原代人脐静脉内皮细胞（HUVECs）一起接种在PDMS系统中，以生成承受剪切应力的微血管网络。工程化微血管具有通畅的管腔，并沿其周围表达VE-粘附素。流动介质引起的剪切应力增加了一氧化氮的分泌，并导致内皮细胞平行于层流方向排列和重新分布肌动蛋白丝。剪切应力还导致动脉标记物Notch1和EphrinB2以及抗血栓标记物Kruppel-like factor 2（KLF-2）/4的基因表达显著增加。在hiPSC-EC微血管中观察到这些对微血管平台剪切应力的响应变化，但在来源于HUVEC的微血管中没有观察到，这表明hiPSC-ECs可能比HUVECs在调节其表型时更具可塑性。综上所述，我们证明了在体外生成完整的工程化微血管的可行性，这些血管复制了天然微血管的一些关键生物学特征。

关键词：动脉；内皮细胞；人诱导多能干细胞；微流体；微血管；剪切应力。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突声明：作者声明，与本文的研究、作者身份和/或出版相关的以下潜在利益冲突：LEN是再生医学公司Humacyte，Inc.的创始人和股东。LEN的配偶拥有Humacyte的股权，LEN在Humacyte's董事会任职。LEN是Humacyte授权专利的发明人，为LEN产生版税。

数字

图1。
图1。
在使用COMSOL对微血管网络进行的硅建模中，显示（A）在入口和出口附近遇到分岔点后，设备中的速度幅值（m/s）分布轮廓是对称的。（B） 装置内存在压力（Pa）梯度，介质重力驱动加载后，压力梯度从高到低（分别从入口到出口）均匀降低。（C） 模拟墙体剪应力（达因/厘米2)在装置入口（左）和装置中部（右），流速为10μL/min的剖面。（D） 注射泵设置显示了连接到聚二甲基硅氧烷（PDMS）装置入口（中间）的含注射器介质（顶部），出口通向15 cc锥形管贮存器（底部）以收集废介质。右侧显示完全连接的PDMS设备的放大图像。
图2。
图2。
定量实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR）显示动脉内皮细胞（EC）特异性基因（A）连接蛋白40、（B）蛋白jagged-2（Jag2）和（C）酪氨酸激酶与免疫球蛋白和表皮生长因子同源域（Tie2）在5天以上上调的时间进程（D1–D5）。（D） qRT-PCR显示Notch1上调的时间进程，（E）Western blot显示与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）相比，从分化第0天（D0）到第5天（D5）Notch1激活（NICD，100 kD带）的蛋白水平表达和人主动脉内皮细胞HAEC对照（从左到右，热休克蛋白90[HSP90]用作负荷控制，底部）。（F） qRT-PCR显示从第0天到第5天（D1-D5）动脉标记物EphrinB2上调的时间进程。A-F中的星号表示P（P）与分化第1天相比<0.02。（G） 与HUVEC和HAEC对照组相比，Western blot显示EphrinB2（37 kD带）从分化第0天（D5）一直到第5天（D五）的蛋白水平表达。下图显示了5天内EphrinB2表达相对于HAEC的定量密度测定，星号表示P（P）与HAEC相比，<0.05，表明在第4天和第5天显著增加。对于qRT-PCR，根据相同互补DNA（cDNA）样品中的平均3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）Ct值，对感兴趣基因的三次重复聚合酶链反应（PCR）反应的3个独立实验的值进行标准化。样本之间感兴趣基因（GOI）转录水平的倍数变化等于2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct（GOI）−Ct（GAPDH），ΔΔCt=ΔCt（ATII）−ΔCt（ATII）。对于所有面板，数据代表每个实验的至少3个观察结果，并表示为平均值±标准平均误差[SEM]。
图3。
图3。
（A） 使用小分子糖原合成酶激酶3β抑制剂CHIR99021，通过2D单层方法在体外5天诱导人多能干细胞衍生内皮细胞（hiPSC EC）定向分化方案示意图。定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）显示内皮细胞（EC）特异性基因（B）CD3、（C）血管内皮细胞（VE）钙粘蛋白和（D）激酶插入域受体（KDR）在5天以上上调的时间进程（D1-D5）。星号表示P（P）与D1相比<0.05。第2天（E）早期中胚层细胞（F）内皮细胞或内皮祖细胞（5天）和（G）在汇合处分离出P0-hiPSC-EC（通过CD31+磁珠选择）的相位对比图像，显示典型的EC鹅卵石形态。第5天典型分化hiPSC集落的免疫荧光染色显示（H）细胞核通过4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）（I）新生的VE-cadherin阳性细胞（红色）和（J）DAPI和VE-cadherin合并，比例尺=200μm。（K） Western blot显示VE-cadherin（132 kD带）在hiPSCs（左侧）中无表达，而在分化第5天（D5，右侧）以HSP90（底部）作为负荷对照时有强表达。（五十） Western blot显示在hiPSCs（左侧）中CD31（130 kD带）无表达，并在分化第5天（D5，右侧）用HSP90（底部）作为负荷对照时强表达。对于qRT-PCR，根据相同互补DNA（cDNA）样品的平均GAPDH-Ct值，对感兴趣基因的三次PCR反应的3个独立实验的值进行标准化。样本之间GOI转录水平的折叠变化等于2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct（GOI）−Ct。（误差栏表示平均值[SEM]的±标准误差，n=3个独立实验）。
图4。
图4。
在纤维连接蛋白涂层板上分化、分离和扩增2至3代后，对人诱导多能干细胞衍生内皮细胞（hiPSC-EC）中选定的内皮细胞（EC）标记物进行免疫荧光分析，显示（A）CD31、（B）血管内皮细胞（VE）-钙粘蛋白、（C）血管性血友病因子（vWF）、（D）的表达内皮型一氧化氮合酶（eNOS）和（E）Ephrin B型受体4（EphB4）。功能分析表明，hiPSC-EC（F）在Matrigel-coated平板上培养24小时后形成网络。比例尺=25μm。定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析hiPSC-EC中相对于人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的内皮细胞（EC）基因表达，（G）通用EC标记物CD31、血管内皮细胞钙粘蛋白和激酶插入域受体（KDR；粉红色），淋巴标志物provero同源盒蛋白1（Prox-1；绿色）、（H）动脉标志物Notch1、EphrinB2和Connexin 40（红色）和静脉标志物鸡卵清蛋白上游启动子转录因子2（Coup-TFII；蓝色），星号表示P（P）与HUVECs相比<0.05。Western blot显示：（I）与HSP90负荷控制的HUVEC相比，分离的hiPSC-EC中CD31表达较强（130 kD带），（J）用肿瘤坏死因子治疗后hiPSC-ECs中细胞内粘附分子1（ICAM-1；100 kD带，显示出可比较的归纳水平。（误差条表示平均值的±标准误差[SEM]和n个=3个独立实验。星号表示P（P）与HUVEC相比<0.05）。
图5。
图5。
（A）聚二甲基硅氧烷（PDMS）的物理模型-连接在玻璃载玻片上的微流体装置，在入口和出口处插入钝针（绿色），用于细胞接种和培养基补充（左），显示人类脐静脉内皮细胞接种的相控图像（HUVEC；中）并在设备中培养4天后附着和增殖HUVEC（右）。对HUVEC生成的微血管进行免疫荧光分析，以检测（B）血管性血友病因子（vWF；绿色，左上和左下，刻度条分别为100μm和50μm）和血管内皮（VE）-钙粘蛋白（红色，右上和右下，刻度线分别为100µm和50µm）。（C） hiPSC-EC生成的微血管的三维共焦显微照片显示管腔的4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色，左侧）和VE-cadherin显示完整的微血管连接（比例尺=100μm）。
图6。
图6。
（A）静态人诱导多能干细胞衍生内皮细胞（hiPSC-EC）微血管形态与（B）流动24小时后hiPSC-ECs形态的相位对比成像。流动24小时后，静态hiPSC-EC的（C）F-actin染色（红色）与（D）F-actim的免疫荧光分析。静置hiPSC-EC微血管中（E）EphrinB2表达（红色）的免疫荧光染色，与流动24小时后（F）EphlinB2表达进行比较。静态hiPSC EC微血管中（G）一氧化氮（NO）产生与流动24小时后（H）NO产生的比较的活细胞免疫荧光分析。流动条件为10μl/mL，持续24小时。比例尺=100μm。
图7。
图7。
定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）显示，与静态对照相比，剪切条件下（A）人诱导多能干细胞衍生内皮细胞（hiPSC EC）微血管中Kruppel样因子2（KLF2）、KLF4、Ephrin B型受体4（EphB4）、Notch1和EphrinB2的基因表达变化，（B）人脐静脉内皮细胞（HUVEC）微血管。根据同一互补DNA（cDNA）样本的平均3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）Ct值，对感兴趣基因的三次重复聚合酶链反应（PCR）反应的3个独立实验的值进行标准化。样本间感兴趣基因（GOI）转录水平的折叠变化等于2-ΔΔCt，其中ΔCt=Ct（GOI。数据表示为相对值（静态剪切）。星号表示P（P）< 0.05. 对于所有面板，数据代表每个实验的至少3个观察值，并表示为平均值±标准平均误差。
请参阅PMC中的此图像和版权信息

类似文章

查看所有类似文章

引用人

  • 用于体外模拟血栓的时空可控微流体剪切应力发生器。
    Yu Z、Chen Y、Li J、Chen C、Lu H、Chen S、Zhang T、Guo T、Zhu Y、Jin J、Yan S、Chen H。 Yu Z等人。 纳米生物技术杂志。2024年4月17日；22(1):187. doi:10.1186/s12951-024-02334-6。 纳米生物技术杂志。2024 PMID：38632623 免费PMC文章。
  • 生物吸气微流体：综述。
    Raj M K、Priyadarshani J、Karan P、Bandyopadhyay S、Bhattacharya S、Chakraborty S。 Raj M K等人。 生物微流体。2023年9月27日；17(5):051503. doi:10.1063/5.0161809。eCollection 2023年9月。 生物微流体。2023 PMID：37781135 审查。
  • 血管生成中信号转导的机械调节。
    Flournoy J、Ashkanani S、Chen Y。 Flournoy J等人。 前细胞发育生物学。2022年8月19日；10:933474. doi:10.3389/fcell.2022.933474。eCollection 2022年。 前细胞发育生物学。2022 PMID：36081909 免费PMC文章。 审查。
  • 芯片上皮肤技术：微工程生理相关体外皮肤模型。
    Zoio P、Oliva A。 Zoio P等人。 药剂学。2022年3月21日；14(3):682. doi:10.3390/药剂学14030682。 药剂学。2022 PMID：35336056 免费PMC文章。 审查。
  • 血管组织工程用预先血管化的微/纳米球形/珠状聚集体。
    Rahimnejad M、Nasrollahi Boroujeni N、Jahangiri S、Rabiee N、RabieeM、Makvandi P、Akhavan O、Varma RS。 Rahimnejad M等人。 纳米Lett。2021年8月18日；13（1）：182。doi:10.1007/s40820-021-00697-1。 纳米Lett。2021 PMID：34409511 免费PMC文章。
查看所有“被引用”文章

工具书类

    1. Nolan DJ、Ginsberg M、Israely E、Palikuqi B、Poulos MG、James D、Ding BS、Schachterle W、Liu Y、Rosenwaks Z等。器官维持和再生中组织特异性微血管内皮细胞异质性的分子特征。开发单元。2013;26(2):204–219.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Mendez JJ、Ghaedi M、Sivarapatna A、Dimitrievska S、Shao Z、Osuji CO、Steinbacher DM、Leffell DJ、Niklason LE。间充质基质细胞在纤维蛋白密封剂中形成血管管，并在体内加速伤口愈合。生物材料。2015;40:61–71.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 威尔斯RG。矩阵刚度在调节细胞行为中的作用。肝病学。2008;47(4):1394–1400.-公共医学
    1. Lacorre DA、Baekkevold ES、Garrido I、Brandtzaeg P、Haraldsen G、Amalric F、Girard JP。内皮细胞的可塑性：淋巴组织微环境外新分离的高内皮微静脉内皮细胞的快速脱分化。鲜血。2004;103(11):4164–4172.-公共医学
    1. Gimbrone MA，Cotran RS，Folkman J.培养中的人类血管内皮细胞：生长和DNA合成。细胞生物学杂志。1974;60(3):673–684.-项目管理咨询公司-公共医学

出版物类型

物质