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.2017年9月12日；7(1):11367.
doi:10.1038/s41598-017-11309-7。

p38α/MK2途径诱导氧化代谢

纳塔莉亚·特伦波莱 1, 胡安·巴勃罗·穆尼奥斯 1 2 三, 康斯坦丁·斯洛博丁纽克 1, 西尔维娅·马林 2 4, 玛尔塔·卡斯坎特 2 4, 安东尼奥·佐扎诺 1 2 三, 安吉尔·R·内布拉达 5 6
附属公司

p38α/MK2途径诱导氧化代谢

纳塔莉亚·特伦波莱等。 科学代表. .

摘要

对环境压力的充分反应对细胞生存至关重要。涉及线粒体能量生成和氧化应激的细胞能量学调控是应激适应和反应过程中的核心。p38α信号通路通过协调多种细胞过程在应激刺激反应中发挥关键作用。然而，p38α通路的长期激活会导致细胞增殖受损，并可能导致细胞死亡。在这里，我们使用一个系统特异性激活p38α信号，并表明持续激活该途径足以诱导重要的代谢变化，包括细胞生存对葡萄糖的高度依赖、谷氨酰胺消耗增加、呼吸速率增强和线粒体活性氧（ROS）生成增加此外，我们提供的证据表明，由于线粒体活性升高，线粒体超氧化物的产生增加，有助于持续p38α激活引发的p38α降低的细胞存活。我们还发现p38α活化激酶MAPKAPK2（MK2）在调节观察到的代谢变化中起着重要作用。我们的结果说明了p38α信号在细胞代谢调节中的一种新功能，这种新功能可能在持续激活该通路后导致细胞死亡。

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作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
MKK6的表达使细胞高度依赖葡萄糖生存。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)使用所示抗体通过免疫印迹分析总细胞裂解物。磷酸化的p38α和p38γ用箭头表示。未截取的免疫印迹如补充图S8所示。(b条)对照细胞和表达MKK6的细胞在完全培养基或无葡萄糖培养基中培养24小时 h，用Annexin V/PI染色测定细胞存活率。活细胞被确定为细胞群膜联蛋白V−和PI−. (c（c）)在完全培养基或无糖培养基中培养24小时的细胞形态 h.棒材 = 50 微米。(d日)在指定时间测量对照组、表达MKK6的细胞和用p38α抑制剂PH797804（PH）处理的表达MKK的细胞的葡萄糖消耗量，并表示为 μmol（摩尔） × 106细胞−1 × 小时−1. (e（电子）)对照细胞和MKK6表达细胞在p38α抑制剂PH797804（PH）存在或不存在的情况下生长指定时间，并分析编码糖酵解基因和GLS1的mRNA的表达水平。结果显示为褶皱向控制方向的变化。(（f）)谷氨酰胺消耗量测定如下(d日). (克)对照组和表达MKK6的细胞培养24小时 在补充2 mM丙酮酸或1 mM二甲基-2-酮戊二酸（αKG），使用Annexin V/PI染色检测细胞存活率。
图2
图2
MKK6表达引发的代谢变化。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)定量脂滴含量24 h和48 在存在或不存在p38α抑制剂PH797804（PH）的情况下，在MKK6诱导后h。(b条)成立14分析新合成的蛋白质和脂质中的C-葡萄糖24 在MKK6诱导后h，表示为向控制方向的折叠变化。(c（c）)使用所示抗体通过免疫印迹法分析在有或无PH的情况下，来自对照细胞和表达MKK6的细胞的总裂解物。未截取的免疫印迹如补充图S8所示。(d日)分析耗氧量12 在PH存在或不存在的情况下诱导MKK6表达后h。结果显示为O的pmoles2每10人消费5细胞。(e（电子）)测定细胞外酸化率12 在有或无PH的情况下诱导MKK6后h。结果显示为分泌h的pmoles+每105细胞。(（f）)在32 h、 并表示为 μmol（摩尔） × 106细胞−1 × 小时−1.
图3
图3
MKK6表达影响线粒体功能。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)使用MitoTracker Deep Red在指定时间测量对照组和MKK6表达细胞的线粒体质量，并用与对照组相比的倍数变化表示。(b条)用免疫印迹法分析对照细胞和MKK6表达细胞的总裂解物。(c（c）)在p38α抑制剂PH797804（PH）存在或不存在的情况下，从对照和表达MKK6的细胞中提取线粒体24 h.通过免疫印迹分析所示线粒体蛋白的表达。未截取的免疫印迹如补充图S8所示。(d日)在有或无PH的24小时内，分析对照细胞和表达MKK6的细胞中线粒体DNA（mtDNA）与基因组DNA（gDNA）的比率 小时(e（电子）)在有无PH值的情况下，在MKK6诱导后的指定时间分析ATP水平，并将其归一化为细胞数量。对照细胞的数值标准化。(（f）)在12和24小时，在有无PH的情况下测量对照细胞和表达MKK6的细胞的线粒体膜电位 小时(克)24岁时对照组和MKK6表达细胞的定量 含有管状（T）、碎片（F）和甜甜圈（D）线粒体的h，Tom 20染色可见。酒吧 = 10 微米。
图4
图4
线粒体活性氧增加有助于MKK6表达诱导的细胞死亡。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)使用Annexin V/PI染色在指定时间测定细胞存活率。活细胞被确定为细胞群Annexin V−和PI−. (b条)在对照和表达MKK6的细胞中在32 h，表示为nmol / 5 × 104细胞。(c（c）)在MKK6诱导后的指定时间，使用DCFH-DA探针分析总ROS水平。数值表示为DCF与对照细胞平均荧光的倍数变化。(d日)24小时后，对照组和MKK6表达细胞中的ROS水平 用DCFH-DA探针分析p38α抑制剂PH797804（PH）或SB203580（SB）对h的影响。数值表示为DCF平均荧光的折叠变化。(e（电子）)模拟处理或SB处理的对照和表达MKK6的细胞中的线粒体ROS水平在24 h使用MitoSox探头。数值表示为针对对照细胞的MitoSox平均荧光的折叠变化。
图5
图5
MKK6表达加速细胞代谢。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)在24小时时，对对照细胞和MKK6表达细胞中的谷胱甘肽含量（总量和减少量）进行分析 h，表示为 微摩尔/10三细胞。(b条)NAC处理的对照细胞和表达MKK6的细胞中的ROS水平（5 mM）和谷胱甘肽（5 mM）在24 使用DCFH-DA探针诱导MKK6后h。(c（c）)用MitoQ（500 nM）在24时进行分析 h使用DCFH-DA探头。(d日)用MitoQ（500 nM）持续2天，通过Annexin V/PI染色分析细胞存活率。数据来自3个独立实验。(e（电子）)分析耗氧率24 在常规条件下诱导MKK6表达和添加MitoQ（500 nM），如图所示。结果以O的pmoles表示2每10人消耗5细胞。
图6
图6
MK2介导MKK6诱导的代谢变化。将表达Tet调节构建体的U2OS细胞模拟处理（对照）或用四环素处理指定的时间，以诱导组成型活性MKK6的表达。(一和b条)葡萄糖消耗(一)和谷氨酰胺消耗(b条)对照组在指定时间测量MKK6表达细胞和用MK2抑制剂PF3644022（MK2i）处理的MKK5表达细胞，并表示为 μmol（摩尔） × 106细胞−1 × 小时−1这些样品平行处理，使用与图1d和f中所示样品相同的对照细胞和表达MKK6的细胞(c（c）)在MKK6诱导后，在MK2抑制剂III（MK2i-III）存在或不存在的情况下，通过qRT-PCR测定参与糖酵解和谷氨酸解的mRNA编码蛋白的表达水平。(d日)在p38α抑制剂PH797804（PH）或MK2抑制剂PF3644022（MK2i）存在或不存在的情况下，从对照细胞和表达MKK6的细胞制备总细胞裂解物，并使用指示的抗体进行免疫印迹分析。未截取的免疫印迹如补充图S8所示。(e（电子）)对照和表达MKK6的细胞在缺乏葡萄糖的条件下，在MK2i存在或不存在的情况下生长24小时 h、 Annexin V/PI染色检测细胞存活率。活细胞被确定为细胞群Annexin V−和PI−.
图7
图7
MK2介导MKK6表达诱导的线粒体功能变化。表达Tet-调节结构的U2OS细胞被模拟处理（对照）或用四环素处理指定时间以诱导组成活性MKK6的表达。(一)对照细胞和表达MKK6的细胞在完全培养基中生长，在有或无MK2抑制剂PF3644022（MK2i）或MK2抑制物III（MK2-III）的情况下培养3天，并使用Annexin V/PI染色检测细胞存活率。活细胞被确定为细胞群Annexin V−和PI−. (b条)对照细胞和表达MKK6的细胞与MK2i或MK2i-III孵育24小时 h、 并使用MitoSox探针分析线粒体ROS水平。数值表示为MitoSox平均荧光的折叠变化，并归一化为对照。(c（c）)对照细胞和表达MKK6的细胞与MK2i孵育24小时 h和线粒体质量由Mitotracker Deep Red分析。数值表示为与对照组相比的折叠变化。(d日)分析耗氧率24 在MK2i存在或不存在的情况下诱导MKK6表达后h。结果显示为消耗O的pmoles2每105细胞。(e（电子）)在指定的时间测量在PH或MK2i存在或不存在的情况下，对照细胞和表达MKK6的细胞的线粒体膜电位。(（f）)在有或无MK2i的情况下，在MKK6诱导后的指定时间分析ATP水平，并将其归一化为细胞数量。
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