Directed Differentiation of Human Bone Marrow Stromal Cells to Fate-Committed Schwann Cells

doi:10.1016/j.stemcr.2017.08.004

.2017年10月10日；9(4):1097-1108.

doi:10.1016/j.temcr.2017.08.004。 Epub 2017年9月7日。

人骨髓基质细胞定向分化为命运依赖性雪旺细胞

萨卡¹, 亚平咀¹, 金威丹¹, 格雷厄姆·卡亨·谢², Richard Shek Kwan Chang先生^三, 强敖⁴, 戴西·郭彦深⁵, 陈英兴⁶

附属公司

¹香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院生物医学学院。
²香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院骨科与创伤学系。
^三香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院医学系。
⁴中国医科大学组织工程系，沈阳，中国。
⁵香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院生物医学学院；香港大学脑与认知科学国家重点实验室，香港特别行政区。电子地址：shumdkhk@hku.hk。
⁶香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院生物医学学院；香港大学脑与认知科学国家重点实验室，香港特别行政区。电子地址：yschan@hku.hk。

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内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2017.08.004

人骨髓基质细胞定向分化为命运依赖性雪旺细胞

萨卡等。干细胞报告. 2017.

.2017年10月10日；9(4):1097-1108.

doi:10.1016/j.temcr.2017.08.004。 Epub 2017年9月7日。

作者

萨卡¹, 一坪咀¹, 金威丹¹, 格雷厄姆·卡亨·谢², Richard Shek Kwan Chang先生^三, 羌敖⁴, 戴西·郭彦深⁵, 陈英兴⁶

附属公司

¹香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院生物医学学院。
²香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院骨科与创伤学系。
^三香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院医学系。
⁴中国医科大学组织工程系，沈阳，中国。
⁵香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院生物医学学院；香港大学脑与认知科学国家重点实验室，香港特别行政区。电子地址：shumdkhk@hku.hk。
⁶香港特别行政区香港大学李嘉诚医学院生物医学学院；香港大学脑与认知科学国家重点实验室，香港特别行政区。电子地址：yschan@hku.hk。

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摘要

我们从成人骨髓基质细胞（BMSCs）体外衍生雪旺细胞（SCs）的最终目的是使其可用于自体，以帮助创伤后神经再生。从骨髓间充质干细胞衍生SC样细胞的现有方案在获得表型的稳定性和髓鞘轴突的功能能力方面存在不足。我们的实验表明，人骨髓间充质干细胞中的神经-表皮祖细胞可以选择性扩增，然后诱导分化为类SC细胞。SC-like细胞与胚胎背根神经节神经元的共培养促进了接触介导的信号传递，从而完成了向命运决定型SCs的转换。微阵列分析和体外髓鞘形成为人类骨髓间充质干细胞衍生的干细胞功能成熟提供了证据。在坐骨神经损伤的大鼠模型中，将衍生的SC接种到神经引导器中作为穿过临界间隙的植入物，在体内观察到的修复和髓鞘形成表型加强了这一点。

关键词：雪旺细胞；骨髓基质细胞；区别；命运承诺；髓鞘形成。

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图1
hBMSC定向分化为命运承诺型SC（A）来源于hBMSC的神经球。（a，b）粘附培养的hBMSCs在表观荧光显微镜下的代表性图像，巢蛋白和GFAP在很大程度上呈免疫阴性。（c）在将人骨髓基质干细胞转移到成球培养基中的非粘附培养物后的第10天，球体（箭头）的代表性图像。（d，e，f）在非粘附的、形成球体的培养物中持续到第14天的球体的代表性图像。在这一阶段，与hBMSCs（g）相比，神经球细胞对nestin和GFAP（e、f和g）基本呈免疫阳性。^∗∗p<0.01，hBMSC衍生神经圈与hBMSC。比例尺，100μm。n=6个独立实验。（B） hBMSC衍生神经球向SCLC的分化。相控图像显示，在补充了GIF的α-MEM贴壁培养的第3天（a）和第5天（b），细胞从神经球中流出，并逐渐呈现出培养第7天（c）SCs典型的双极和三极形态。补充GIFs（+GIFs）（d，e，合并为f）的α-MEM中神经球衍生SCLC中S100和p75NTR的免疫荧光，对比DMEM/F12中标记物的免疫负性和GIFs的撤回（g，h，合并为i）。直方图显示补充GIF（+GIF）的培养物中所示标记的SCLC免疫阳性百分比与撤回GIF的培养物（j）。^∗∗p<0.01，SCLC（+GIF）与SCLC（GIF撤回）。比例尺，100μm。n=6个独立实验。（C） SCLC与DRG神经元共培养后对SC命运的承诺。在第3天（a）和第7天（b），在没有补充GIF或DRG神经元的基础培养液中hBMSC-dSCs的相位对照图像。平行培养纯化DRG神经元的相控图像（g）。S100-和p75NTR-阳性（c，d，合并在e中）但TUJ1-阴性（f）的hBMSC-dSC，与S100-、p75NTR阴性（h）但TUJ-阳性（i）的DRG神经元形成对比。直方图显示所示标记物的hBMSC-dSCs免疫阳性百分比与纯化DRG神经元的零百分比（j）。^∗∗p<0.01，hBMSC-dSC与DRG神经元。比例尺，100μm。n=6个独立实验。

图2
hBMSCs、神经球细胞、SCLCs和hBMSC-dSCs的标记蛋白谱（A）hBMSC和hBMSC衍生神经球细胞裂解物中巢蛋白和GFAP的Western blot分析（上部）。根据β-肌动蛋白（低）的密度归一化谱带强度的密度扫描图。^∗∗p<0.01，神经球细胞与hBMSC。n=6个独立实验。（B） Western blot分析各hBMSC-derived细胞类型（神经球细胞、补充GIF培养的SCLC（+GIF）以及GIF退出后3天（GIF退出）和hBMSC-dSCs）裂解液中p75NTR、S100和nestin的蛋白印迹。根据β-肌动蛋白（低）的密度归一化谱带强度的密度扫描图。^∗p＜0.05，^∗∗p<0.01，SCLC（+GIFs）和SCLC（GIFs撤回）与神经球细胞的比较。##p<0.01，hBMSC-dSC与SCLC（GIF已撤销）。n=6个独立实验。

图3
*体外试验*hBMSC-dSCs对DRG神经网络的髓鞘化（A）相位对照图像，显示hBMSC-dSCs（箭头）与神经元在神经元维持培养基（A）中纯化的DRG神经元神经网络共培养48小时时与神经元相关。平行培养中S100和TUJ1的免疫荧光显示hBMSC-dSC（箭头）紧靠神经突（b；右侧面板，方框区域i–iii的放大视图）。在髓鞘形成诱导14天后，hBMSC-dSC沿着神经网络形成髓鞘样片段（双头箭头），如相位对比（c）和MBP的免疫荧光（d）所示。比例尺，100μm。（B）与DRG神经元并行共培养的hBMSCs（箭头所示）显示成纤维细胞样形态（a），并且未能沿神经突形成MBP阳性片段（B）。比例尺，100μm。（C）与DRG神经元的神经炎网络并行共培养的SCLC（箭头所示）恢复为肌成纤维细胞表型（a），并未能沿神经炎形成MBP阳性片段（b）。比例尺，100μm。（D）直方图显示hBMSC-dSC在十个字段中的有髓段计数，而hBMSC几乎没有(^∗∗p<0.01）或SCLC（##p<0.1）。n=5个独立实验。

图4
hBMSC-dSCs分泌的神经营养因子（A）对由Neuro2A细胞（对照）调节的培养基中的BDNF（A）、VEGF（b）、HGF（c）和NGF（d）与Neuro5A与hBMSCs、SCLCs或hBMSC-dSCs共培养24小时的培养基进行分析。使用（+）或不使用（−）针对指示因子的中和抗体处理共培养物。将来自对照组、hBMSCs、SCLC和hBMSC-dSCs的条件培养液中BDNF、VEGF、HGF和NGF的水平与抗体治疗后的水平进行比较。^∗p<0.05，^∗∗p<0.01。n=5个独立实验。（B）在第0天、第1天或第2天，分析由Neuro2A细胞（对照）调节的培养基与由NeuroSA与hBMSCs、SCLCs或hBMSC-dSCs共培养调节的培养液中的BDNF（a）、VEGF（B）、HGF（c）和NGF（d）。^∗∗第1天或第2天与第0天相比，p<0.01##p<0.01，hBMSC-dSCs与hBMSCs或SCLC的比较。n=5个独立实验。

图5
hBMSC-dSCs介导的神经突起生长（A）代表性图像，显示在纯培养基（A，对照）中保持的Neuro2A细胞（箭头）与与hBMSCs（b）、SCLCs（c）、hBMSCd-SCs（d）或具有BDNF、VEGF、HGF阻断抗体的hBMSC-dSCs共培养48小时的细胞的相控视图，在培养基（e）中添加NGF。比例尺，50μm。（B）直方图显示了在纯培养基（对照）中或与具有BDNF阻断抗体的hBMSCs、SCLCs、hBMSC-dSCs或hBMSC-dSCs共培养的Neuro2A细胞中，含有至少一个≥细胞体直径（a）、每细胞最长神经突长度（B）和每细胞总神经突长度的细胞百分比（c），VEGF、HGF和/或NGF。^∗p<0.05，^∗∗p＜0.01，具有或不具有阻断抗体的hBMSC-dSC与hBMSC相比#p<0.05，##p<0.01，具有阻断抗体的hBMSC-dSC与没有阻断抗体的hBMSC-dSC。n=5个独立实验。

图6
hBMSC-dSCs与hSCs高度相似（A）热图中显示的差异表达重叠基因的层次聚类。蓝色和黄色表示由颜色键定义的最高和最低相对表达级别。（B）描述SCLC、hBMSC-dSCs和hSCs中下调（左）和上调（右）基因数量的文氏图，与hBMSCs相比。（C）所示细胞之间表达谱的成对比较。蓝色虚线表示2倍的变化。差异表达基因（红色）是显著差异的2倍（p<0.05）。（D） 64个与雪旺细胞分化相关基因的微阵列数据的热图。蓝色和黄色表示由颜色键定义的最高和最低的相对表达水平。（E）微阵列数据的qPCR验证。GAPDH作为内生标准，数据根据hBMSC样本进行标准化。

图7
在大鼠坐骨神经损伤模型中，hBMSC-dSCs通过植入桥接关键间隙的神经导管使宿主轴突髓鞘化。在坐骨神经导管中部制作的纵切面揭示了以下内容。（A）大鼠TUJ1的单向排列纤维免疫阳性，代表再生纤维。（B）人MBP免疫阳性的纵向层之间的一排Hoechst染色细胞核。（C）髓鞘轴突和一排排位于外周的细胞核让人想起（A）和（B）合并图像中的雪旺细胞。（D）髓鞘结构在横切面的TEM图像中显示（放大后为D^∗). 比例尺，（A）–（C）为50μm，（D）为200 nm。

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