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.2017年10月27日；292（43）：17668-17680。
doi:10.1074/jbc。M117.798231。 Epub 2017年9月7日。

Rho ADP-核糖基化C3外酶通过Arg-Gly-Asp基序结合细胞

阿斯特里德·罗尔贝克 1, 马库斯·霍尔特耶 2, 安德烈·阿道夫 2, 伊丽莎白·奥姆斯 三, 桑德拉·哈格曼 三, 古德伦·阿赫内特·希尔格 2, Ingo Just公司 三
附属公司

Rho ADP-核糖基化C3外酶通过Arg-Gly-Asp基序结合细胞

阿斯特里德·罗尔贝克等。 生物化学杂志. .

摘要

Rho ADP-核糖基化C3外酶（C3bot）是一种不含细胞结合或易位结构域的细菌蛋白毒素。然而，C3可以有效地进入完整的细胞，包括神经元，但C3结合和摄取的机制尚不清楚。此前，我们确定中间丝波形蛋白是C3的细胞外膜相互作用伙伴。然而，在缺乏波形蛋白的情况下，细胞仍会吸收C3（尽管减少了），这表明存在额外的宿主细胞受体。C3含有一个Arg-Gly-Asp（RGD）基序，它是主要的整合素结合位点，存在于多种整合素配体中。为了检查C3的RGD基序是否与细胞结合有关，我们对C3和RGD肽或与β1-整合素亚基结合的单克隆抗体进行了竞争分析，并对不同细胞系、初级神经元和突触体与C3-RGD突变体进行了结合分析。在这里，我们报告了用GRGDNP肽预孵育细胞可以显著降低C3与细胞的结合。此外，RGD基序的突变降低了C3与完整细胞和重组波形蛋白的结合。抗整合素抗体也降低了C3与细胞的结合。我们的结果表明，C3的RGD基序至少是一个与宿主细胞结合的必需C3基序，整合素是除波形蛋白外的C3的附加受体。

关键词：ADP-核糖基化；ADP-核糖基转移酶；C3外酶；RGD；细菌毒素；结合；整合素；配体结合蛋白；蛋白质相互作用；波形蛋白。

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利益冲突声明

作者声明，他们与本文的内容没有利益冲突

数字

图1。
图1。
A、，C3与完整的初级波形蛋白敲除和野生型神经元的结合。混合海马/新皮质神经元暴露于300 n米C3在4°C下保持1小时。随后，将细胞严格洗涤三次，裂解，并进行针对C3和β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析。显示了来自典型实验的蛋白质印迹(n个= 5).B、，图中描述了结合C3的密度测定评估和相应β-肌动蛋白带的调整。C3处理的野生型神经元结合C3的信号强度设置为1。数据代表五个独立实验的平均值±S.D。统计差异由Student’st吨测试（***，第页≤ 0.001).
图2。
图2。
A、，用可溶性RGD肽进行的竞争试验显示C3与RGD实体的结合特异性。HT22细胞在4°C下与100μg/ml的GRGDNP预孵育30分钟，然后与100 n孵育米C3在4°C下保持1小时。作为阴性对照(数控)添加RGES肽。随后，将细胞严格清洗三次，进行裂解，并提交针对C3和β-肌动蛋白的Western blot分析。显示了来自典型实验的蛋白质印迹(n个= 6).B、，图中描述了结合C3的密度测定评估和相应β-肌动蛋白带的调整。C3处理细胞结合C3的信号强度设置为1。数据表示六个独立实验的平均值±S.D。统计差异由ANOVA和Dunnett的倍数决定t吨测试（*，第页≤ 0.05; **,第页≤ 0.01).C、，HT22细胞在4°C下与100μg/ml的GRGDNP预孵育30分钟，然后与500 n孵育米C3在37°C下保持8小时。随后，对细胞进行三次严格清洗、裂解，并提交至针对RhoA、ADP-核糖基化RhoA和β-肌动蛋白的Western blot分析。来自C3处理细胞（无预培养）的ADP-核糖基化RhoA的信号强度设置为1。显示了来自典型实验的蛋白质印迹(n个= 4).D、，密度分析(C类)显示ADP-核糖基化Rho抗体。数据表示四个独立实验的平均值±S.D。统计差异由ANOVA和Dunnett的倍数确定t吨测试（*，第页≤ 0.05; **,第页≤ 0.01).E、，将HT22细胞与3μl/ml mAb D2E5在4°C下预孵育至β1-整合素亚基30分钟，然后与500 n孵育米C3在4°C下保持1小时。随后，将细胞严格清洗三次，进行裂解，并提交针对C3和β-肌动蛋白的Western blot分析。显示了来自典型实验的蛋白质印迹(n个= 3).F、，图中描述了结合C3的密度测定评估和相应β-肌动蛋白带的调整。来自C3处理细胞（未与抗体预孵育）的ADP-核糖基化RhoA的信号强度设置为1。数据代表三个独立实验的平均值±S.D。统计差异由ANOVA和Dunnett的倍数确定t吨测试（*，第页≤ 0.05).
图3。
图3。
A、，HT22细胞暴露于浓度增加的C3和C3-RGD突变体（C3-D90G和C3-D90N）和C3-G89I(B类)在4°C下保持1小时。随后，将细胞严格清洗三次，进行裂解，并提交针对C3和β-肌动蛋白的Western blot分析。重复分析C3和C3-D90N(A类和B类).C、，图示结合C3的密度测定评估和相应β-肌动蛋白带的调整(n个= 5). 结果表示五个独立实验的算术平均值±S.D。C3和C3-RGD突变处理细胞之间的统计差异通过ANOVA和Dunnett的倍数确定t吨测试。与浓度为500和1000 n的C3相比，结果具有统计学意义米值，第页≤0.05。
图4。
图4。
A、，C3覆盖层（C3与波形蛋白的结合）。按照“实验程序”所述纯化重组波形蛋白（35μg），然后通过SDS-PAGE分离并转移到硝化纤维素上。硝化纤维素与10μg/ml C3或C3-RGD突变体（如图所示）在4°C下孵育1小时。洗涤后，用抗C3检测结合C3。BSA作为阴性对照。B、，图中描述了结合C3的密度测定评估和蛋白质阶梯70-kDa参考带的调整(n个= 4). 结合C3-WT的信号强度设置为1。数据代表四个独立实验的平均值±S.D。统计差异通过ANOVA和Dunnett倍数确定t吨测试（*，第页≤ 0.05; **,第页≤ 0.01).
图5。
图5。
A、，波形蛋白与C3或C3-RGD突变体的结合（如图所示）。通过SDS-PAGE分离纯化的C3（4μg）或C3-RGD突变体（4μg）并转移到硝化纤维素上。将硝化纤维素与10μg His标记的波形蛋白在4°C下培养60分钟。洗涤后，用五H多克隆抗体检测结合波形蛋白。BSA作为阴性对照。B、，显示了加载C3样品的Western blot。C、，图中描述了结合波形蛋白的密度测定评估以及对α-C3蛋白印迹中相应条带的调整(n个= 3). 结合His-tagged C3-WT的信号强度设置为1。数据表示三个独立实验的平均值±S.D。统计差异由ANOVA和Dunnett的倍数确定t吨测试（*，第页≤ 0.05; **,第页≤ 0.01).
图6。
图6。
A、，从小鼠脑匀浆、核后上清液和突触体悬浮液中制备总蛋白（20μg），并将其与突触蛋白突触素、β1-整合素、中间丝波形蛋白和胶质纤维酸性蛋白进行Western blot分析(GFAP公司). β-肌动蛋白作为负荷控制。B、，突触体与300n孵育米C3或C3-G89I在4°C下保持1小时。随后，对突触体进行严格清洗、裂解，并提交至针对C3和β-肌动蛋白的Western blot分析。C、，C3的结合表现为三个生物三倍体的结合(n个= 1). 结合C3进行密度测定并调整到相应的β-肌动蛋白和C3输入带。
图7。
图7。
A、，His-C3bot和His-C3stau2与完整海马HT22细胞的结合。细胞暴露于100或500 n米His-C3bot或His-C3stau2在4°C下保持1小时。随后，对细胞进行三次严格清洗、裂解，并提交至针对五氢和β-肌动蛋白的蛋白质印迹分析。显示了来自典型实验的蛋白质印迹(n个= 5).个人电脑、，阳性对照，在5×Laemmli缓冲液中加入25 ng His-C3bot或His-C3stau2。B、，图中描述了结合的His标记C3的密度测定评估和相应的β-肌动蛋白带的调整。500 n束缚His-C3的信号强度米His-C3bot处理的HT22细胞设为1。数据表示五个生物重复物独立实验的平均值±S.D。统计差异通过ANOVA和Dunnett倍数确定t吨测试（*，第页≤ 0.05; **,第页≤ 0.01; ***,第页≤ 0.001).C、，His标记C3与完整的初级波形蛋白敲除和野生型神经元的结合。混合海马/新皮质神经元暴露于300 n米His-C3bot或His-C3stau2在4°C下保持1小时。随后，对初级神经元进行严格清洗、裂解，并提交至针对五氢嘧啶和β-肌动蛋白的Western blot分析。D、，图中描述了结合的His标记C3的密度测定评估和相应的β-肌动蛋白带的调整。300 n束缚His-C3的信号强度米His-C3bot处理的野生型神经元设为1。数据表示五个独立实验的平均值±S.D。统计差异由ANOVA和Dunnett的倍数确定t吨测试（*，第页≤ 0.05; **,第页≤ 0.01).
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