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.2017年8月22日10:266。
doi:10.3389/fnmol.2017.00266。 2017年电子收集。

PPT1过度表达神经元样细胞轴突和突触室中棕榈酰化蛋白编码基因网络受到影响

弗朗西斯科·佩齐尼 1, 玛齐娅·比安奇 2, 萨尔瓦托·本法托 三, 弗朗西丝卡·格里乔 三, 斯特凡诺·多奇尼 4, 罗莎尔巴·卡罗佐 2, 阿维达斯·达普库纳斯 5, 马西莫·德莱多内 三, 菲利波·桑托雷利 4, 马西耶·姆拉洛夫斯基（Maciej M Lalowski） 5, 亚历山德罗·西蒙纳蒂 1
附属机构

PPT1过度表达神经元样细胞轴突和突触室中棕榈酰化蛋白编码基因网络受到影响

弗朗西斯科·佩齐尼等。 前臼齿神经科学. .

摘要

CLN1病（OMIM#256730）是一种与突变相关的儿童早期蜡样脂褐质沉积症CLN1型其产物棕榈酰蛋白硫酯酶1（PPT1）是一种溶酶体酶，参与从S-酰化蛋白中去除棕榈酸残基。在神经元中，PPT1的表达也与突触室有关。这项研究的目的是揭示与CLN1型.我们利用过度表达野生型SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞CLN1型（SH-p.wtCLN1）和五名选定的CLN1患者的突变。wtPPT1的细胞分布与内源性蛋白的常规加工一致，部分在溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）阳性囊泡中检测到，而突变体表现出更为弥漫的细胞质模式。转录组分析显示SH-p.wtCLN1中有802个差异表达基因（DEGs）（与空载体转染细胞相比），而在两个突变体（p.L222P和p.M57Nfs*45）中检测到的DEGs数量明显更低。生物信息学研究将二甘醇与神经突起形成和神经传递联系起来。具体地说，神经原的生成和神经元突起的增殖被预测在wt中受到阻碍CLN1型过度表达的细胞株，这些发现被形态学研究证实。棕榈酰化调查在SH-p.wtCLN1中鉴定出113个棕榈酰化蛋白编码基因，其中25个基因同时分配给轴突生长和突触室。免疫印迹证实，与轴突伸长（GAP43、CRMP1和NEFM）和突触标记SNAP25（尤其是在SH-p.wtCLN1细胞中）功能相关的棕榈酰化蛋白的表达显著下降。随后，对分配给突触注释的DEG的生物信息网络调查显示，有81个DEG与之相关，其中23个DEG编码棕榈糖基化蛋白。在这个实验环境中获得的结果概述了两个受影响的功能模块（连接到轴突和突触室），这可能与wt基因剂量的改变有关CLN1型此外，这些模块与PPT1功能丧失相关的病理效应相关，与第1页敲除小鼠和CLN1疾病患者。

关键词：CLN1疾病；PPT1；RNA-seq；分化的神经母细胞瘤细胞；失调基因；神经炎发生；棕榈酰化。

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数字

图1
图1
的特征CLN1型mRNA和相应的棕榈酰蛋白硫酯酶1（PPT1）蛋白表达CLN1型转染细胞。（A）qRT-PCR定量转染小鼠mRNA表达CLN1型细胞。所有转染细胞均显示CLN1型与对照组（亲代和空载体pcDNA3，模拟转染细胞）的内源性水平相比，mRNA的变化范围为5-15倍。三个独立实验的平均值±SEM；采用Bonferroni的多重比较检验进行单因素方差分析***第页< 0.001.（B）PPT1（绿色）和溶酶体标记物LAMP2（红色）的双重免疫荧光（IF）检测显示，PPT1在细胞中的强信号稳定表达CLN1型（b和c）或两种不同的错义突变（p.L222P，e和f；p.V181L，h和i）。空载体表达细胞（a）CLN1型插入（p.M57Nfs*45，d）和CLN1型删除（p.G42_E78del，g）显示在比较中。在溶酶体内观察到SH-p.wtCLN1（插入c）的部分定位，而在SH-p.L222P和SH-p.V181L（f和i）中检测到更弥漫的细胞质模式。细胞核用白色星号标记；对于插页（c、f和i），刻度条等于20μm（h）和10μm。彩色化显示为黄色。（C）免疫印迹分析证实PPT1在SH-p.wtCLN1细胞和具有错义突变的细胞系中过度表达。在wt的匀浆中检测到38–36 kDa双链CLN1型细胞。一种不同的模式与携带PPT1蛋白形式的错义突变有关——在这些蛋白的匀浆中检测到一个约41kDa的单一条带CLN1型只有突变体。在转染了吲哚突变，38–36 kDa的双联体只能在高暴露后鉴定，提示内源性PPT1信号的表现。NT，非处理；全反式维甲酸-神经基础培养基（RA-NBM），分化细胞。（D）与SH-pcDNA3空载体细胞相比，SH-p.wtCLN1中PPT1酶活性（EA）显著增加（3倍变化）。亲本SH-SY5Y和携带不同突变的细胞系在PPT1 EA中表现出一定的可变性，与空载体转染的细胞系相比变化不到0.25倍。三个独立实验的平均值±SEM；采用Bonferroni的多重比较检验进行单因素方差分析***第页< 0.001.
图2
图2
转录组学分析CLN1型转染细胞系。（A）显示SH-p.wtCLN1细胞中差异表达基因数量的文氏图(n个=802）和两个突变的CLN1型-转染细胞系(n个=212，SH-p.L222P和n个=211，SH-p.M57Nfs*45）。值得注意的是，629个差异表达基因（DEGs）在SH-p.wtCLN1克隆中独家表达。对RA-NBM分化细胞系进行差异基因表达分析，并与在相同培养条件下分析的空载体表达细胞（SH-pcDNA3）进行比较。（B–D）分化SH-p.wtCLN1中差异表达基因的散点图表示（B），SH-p.L222P型（C）和SH-p.M57Nfs*45（D）细胞。基因表达水平报告为log2（FPKM）(年轴）并与分化的SH-pcDNA3细胞进行比较(x个轴）。彩色点代表差异表达基因（阈值：|log2FC|>1和q个-值<0.05），它们是上调的（红点）或下调的（绿点）。
图3
图3
野生型和突变型差异表达基因的生物信息学调查CLN1型细胞系。（A–C）通过灵巧路径分析（IPA，Qiagen）对分化的SH-SY5Y细胞中的DEG进行分类。分子和细胞功能以及生理系统发育与功能对IPA等级进行了检查。的类别细胞发育,细胞间信号传递和相互作用,细胞形态学以及神经系统发育和功能修正了最低B-H第页-价值观被进一步审查。报告了分配给每个类别的基因数量。统计显著性报告为–log10本杰明·霍伯格修正第页-值。（D）Heat-map表示描述了包含在细胞发育,细胞间信号传递和相互作用,细胞形态学和神经系统发育和功能.与神经元细胞形态变化相关的细胞功能(神经突起的生长/分支/形态发生和轴突发生)和神经元承诺(神经元的分化，神经元的发育)通常在SH-p.wtCLN1和两个突变细胞系中受到影响，根据z（z）-分数（从最高到最低）。与神经元传递相关的功能(长时程增强、神经递质分泌和神经递质)还添加了注释。值得注意的是，与神经元突起有关的其他注释(树突状生长/分支，突起形状改变,神经元的形状变化/分支,轴突导向)以及突触传递(突触的发育过程、突触的长期增强、突触可塑性、神经递质的释放和细胞动作电位)仅选择性地分配给SH-p.wtCLN1细胞。IPA类之间共享的功能注释用圆点标记。彩色方块表示根据z（z）-IPA算法计算得分；较高的颜色强度与更显著的生物信息学预测相关。
图4
图4
棕榈酰化基因/蛋白质调查。（A）SH-p.wtCLN1、SH-p.L222P和SH-p.M57Nfs*45转录组图谱中差异表达基因与表达空载体（SH-pcDNA3）的细胞相比，确定的棕榈酰化基因产物（棕榈酰化蛋白）的文氏图。已识别的二甘醇的数量在细胞系名称下方说明，而三种比较中共享的基因数量在维恩图的交叉处报告。其中85个基因仅在SH-p.wtCLN1中选择性表达。各基因简编见补充表S4、S5、S6CLN1型细胞系和补充图S4，用于分配给维恩图中每个相互作用区域的基因。（B）在SH-p.wtCLN1细胞中特异表达的25个基因与神经系统发育和功能以及与神经突形成有关的注释。还链接了细胞成分GO术语（PANTHER）。尤其是，CTSD公司发现与CLN10疾病相关的野生型表达上调PPT1（PPT1）-过度表达细胞，进一步支持这两个神经元类蜡样脂褐质酶（NCL）基因之间的遗传相互作用。有关编码棕榈糖基化蛋白和指定IPA功能和GO术语的已识别基因的详尽概要，请参阅补充材料中的表S7。通过Western Blotting（WB）分析进一步研究以黑色斜线标记的基因的蛋白质表达。
图5
图5
对SH p.wtCLN1细胞中鉴定的选定DEG进行免疫印迹分析，并编码棕榈糖基化蛋白。（A）由四个下调基因（NF-M、CRMP1、GAP43和SNAP25）编码的代表性蛋白质WB，在SH p.wtCLN1转录组图谱中鉴定。SH-p.wtCLN1细胞裂解物中的蛋白质表达明显减少，而其他细胞系中无明显影响。（B–E）对相同蛋白的半定量WB分析证实，无论是在基础条件下还是在RA-NBM培养基中分化后，SH-p.wtCLN1细胞中这些标记物的表达均显著降低。RA-NBM分化后，在SH-p.L222p裂解物中检测到CRMP1（亚型2）、NF-M和SNAP25的短60kDa亚型表达轻微下调，而在同一细胞系中未观察到GAP43表达的显著变化。GAPDH作为内部标准；a.u.任意单位；三个独立实验的平均值±SEM；双向方差分析，然后是Bonferroni的后测*第页< 0.05, **第页< 0.01, ***第页< 0.001.
图6
图6
中性粒陨石的生长特征CLN1型在RA-NBM培养基中神经元分化后的转染细胞系。（A）神经突起的生长CLN1型通过β-III微管蛋白免疫染色在神经元分化过程中评估转染细胞系。与模拟转染细胞和其他细胞相比，SH-p.wtCLN1细胞的树状突起较少，发育迟缓CLN1型转染细胞系。细胞核用蓝色标记；DIV，天在体外; 刻度条等于50μm。有关细胞形态的定性评估，请参见补充材料中的图S6。（B）根据生物信息学的发现，β-III微管蛋白免疫标记过程的形态计量学分析明确指出SH-p.wtCLN1细胞中长度超过30μm的突起明显不足。同样，SH-p.L222P克隆也有类似的趋势，尽管并不显著。SH-p.M57Nfs*45的变异性较高。这些发现与补充材料图S7中描述的神经丝免疫标记结构的结果类似。三个独立实验的平均值±SEM；单向方差分析，然后是Bonferroni的后测*第页< 0.05.（C）β-III微管蛋白的免疫印迹分析表明，该细胞骨架标记物仅在SH-p.wtCLN1中表达减少，与轴突数量减少一致。Arrow指出SH-p.wtCN1细胞中β-III微管蛋白表达降低。（D）半定量WB分析证实，在RA-NBM培养基中分化后，SH-p.wtCLN1中β-III微管蛋白的表达降低。GAPDH作为内部标准；a.u.任意单位；三个独立实验的平均值±SEM；未成对的t吨-测试*第页< 0.05.
图7
图7
对分配给突触室的二甘醇的生物信息学调查。（A）研究了SH-p.wtCLN1转录组剖面的四个IPA功能注释，以及与神经元传递相关的功能注释。分配给每个类别的DEG数量在括号中报告，而相关的z（z）-分数报告如下（绿色=预测抑制；红色=预测激活）。四个IPA属性包含81个独特的DEG，这些DEG作为进一步生物信息学查询的输入。（B）使用Cytoscape软件中的GeneMANIA插件绘制的包含81个DEG的功能网络。遗传和物理交互作用均用于表示桥接节点。厚边界精确定位在SH-p.wtCLN1中特异性表达的DEG，并且不与其他两个突变体共享。编码棕榈糖基化蛋白的基因用红色标记。间隙43和BCAN公司节点代表SH-p.wtCLN1转录组的下调基因。GAP43（总距43）编码与神经元细胞生长锥相关的膜蛋白（更多信息请参阅讨论部分），而BCAN公司编码brevican，一种硫酸软骨素蛋白多糖，在突触空间的细胞外基质中高度表达（Blosa等人，2015）。（C）通过PANTHER分类系统获得的81个DEGs的统计过表达谱将它们与突触室以及轴突联系起来（细胞成分GO术语分类）。同样，许多基因参与膜通道活性和调节，以及神经传递和谷氨酸受体活性（分子功能GO术语）。Fold Enrichment（FE）分数代表包含在特定术语中的一部分基因。分数超过1（用绿线标记）表示代表性过高。GO术语根据相关的本体类进行分组，并根据FE得分的下降进行分层排序，从最具体的子类开始，到不太具体的子类别。仅显示与FE分数大于预期值相关的每个类别的最具体类别。P（P）-使用Bonferroni校正对多次测试的值进行调整，并报告为−log10(第页-值）；红线表示第页-值等于0.05。
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