Zoledronate dysregulates fatty acid metabolism in renal tubular epithelial cells to induce nephrotoxicity

doi:10.1007/s00204-017-2048-0

.2018年1月；92(1):469-485.

doi:10.1007/s00204-017-2048-0。 Epub 2017年9月4日。

唑来膦酸盐失调肾小管上皮细胞脂肪酸代谢诱导肾毒性

郑莉莉¹, 葛梦梦^1 2, 周兰¹, 马志龙¹, 温娜·池^1 三, 邝文华¹, 孙坤¹, 赵新斌¹, 叶柳¹, 亚千峰¹, 黄跃东¹, 罗茂国², 李萍（Liping Li）¹, Bin Zhang（张斌）⁴, 胡晓宇⁴, 徐丽娜（Lina Xu）⁵, 刘晓辉⁵, 伊霍⁶, 海腾登⁶, 杨金良^三, 乔兰西², 张永辉^1 三, 朱莉·西根塔勒⁷, 陈立功（Ligong Chen）^8 9

附属公司

¹清华大学药物科学学院，100084，北京，中国。
²清华大学生命科学学院，中国北京。
^三四川大学华西医学院华西医院生物治疗与癌症中心国家重点实验室生物治疗协同创新中心，中国成都。
⁴清华大学医学院免疫学研究所，北京，中国。
⁵清华大学生命科学学院蛋白质科学技术中心，北京，中国。
⁶清华大学生命科学学院教育部生物信息学重点实验室，北京，中国。
⁷美国科罗拉多大学丹佛-安舒茨医学院儿科。
⁸清华大学药物科学学院，100084，北京，中国。ligongchen@biomed.tinghua.edu.cn。
⁹四川大学华西医学院华西医院生物治疗与癌症中心国家重点实验室生物治疗协同创新中心，中国成都。ligongchen@biomed.tsinghua.edu.cn。

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内政部： 2007年10月7日/00204-017-2048-0

唑来膦酸盐失调肾小管上皮细胞脂肪酸代谢诱导肾毒性

郑莉莉等。 Arch Toxicol公司. 2018年1月.

.2018年1月；92(1):469-485.

doi:10.1007/s00204-017-2048-0。 Epub 2017年9月4日。

作者

郑莉莉¹, 蒙蒙阁^1 2, 周兰¹, 马志龙¹, Chi温娜^1 三, 邝文华¹, 孙坤¹, 赵新斌¹, 叶柳¹, 亚千峰¹, 黄跃东¹, 罗茂国², 李萍（Liping Li）¹, Bin Zhang（张斌）⁴, 胡晓宇⁴, 徐丽娜（Lina Xu）⁵, 刘晓辉⁵, 伊霍⁶, 海腾登⁶, 杨金良^三, 乔兰西², 张永辉^1 三, 朱莉·西根塔勒⁷, 陈立功（Ligong Chen）^8 9

附属公司

¹清华大学药物科学学院，100084，北京，中国。
²清华大学生命科学学院，北京，中国。
^三四川大学华西医学院华西医院生物治疗与癌症中心国家重点实验室生物治疗协同创新中心，中国成都。
⁴清华大学医学院免疫学研究所，北京，中国。
⁵清华大学生命科学学院蛋白质科学技术中心，北京，中国。
⁶清华大学生命科学学院教育部生物信息学重点实验室，北京，中国。
⁷美国科罗拉多大学丹佛-安舒茨医学院儿科。
⁸清华大学药学院，100084，中国北京。ligongchen@biomed.tsinghua.edu.cn。
⁹四川大学华西医学院华西医院生物治疗与癌症中心国家重点实验室生物治疗协同创新中心，中国成都。ligongchen@biomed.tsinghua.edu.cn。

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内政部： 2007年10月7日/00204-017-2048-0

摘要

唑来膦酸盐是一种广泛用于治疗代谢性骨疾病的二膦酸盐。然而，静脉注射唑来膦酸钠会引起与急性肾小管坏死和肾纤维化相关的显著肾毒性。据推测，唑来膦酸盐诱导的肾毒性可能是由于其作为甲羟戊酸途径抑制剂的药理活性所致，但其分子机制尚不完全清楚。在本报告中，将人类近端肾小管HK-2细胞和小鼠模型结合起来，以解剖唑来膦酸盐治疗引起肾病的分子途径。代谢组学和蛋白质组学分析表明，与对照组相比，唑来膦酸盐处理的HK-2细胞（50μM）中的多个细胞过程被显著破坏，包括TGFβ途径、脂肪酸代谢和小GTPase信号传导。唑来膦酸钠对细胞（50μM）和小鼠（3 mg/kg）的治疗增加了TGFβ/Smad3通路的激活，从而诱导纤维化和肾损伤，并特别增加了脂质积累和纤维化蛋白的表达。相反，脂肪酸转运蛋白Slc27a2缺乏或联合服用PPARA激动剂非诺贝特（20 mg/kg）可防止唑来膦酸诱导的小鼠脂质积聚和肾纤维化，表明脂肪酸转运体SLC27A2的过度表达和唑来膦酸钠治疗后脂肪酸β-氧化缺陷是导致其肾毒性的重要因素。这些药理学和遗传学研究为唑来膦酸盐相关肾脏毒性提供了重要的机制性见解，这将有助于开发这种肾病的治疗性预防和治疗方案。

关键词：脂肪酸转运体；脂质积累；肾纤维化；TGFβ1信号转导；佐勒德罗纳特。

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该手稿不包含临床研究或参与者数据。

数字

图1
用唑来膦酸盐（50µM）处理或不处理HK-2细胞48小时的蛋白质组数据分析。一HK-2细胞的存活曲线。用不同剂量的唑来膦酸盐（0、0.1、1、5、10、50µM）处理HK-2细胞24、36、48、60和72小时。b条唑来膦酸钠处理HK-2细胞后蛋白质显著变化的热图。**c（c）**对照组和唑来膦酸盐处理的HK-2细胞的基因本体（GO）分析。这个图表显示负日志第页特定途径的富集值。d日与TGFβ和炎症相关的相对蛋白水平。**e（电子）**与纤维化和肾损伤相关的相对蛋白质水平。**（f）**与脂质和FA代谢相关的相对蛋白质水平。数据表示为平均值±标准偏差（每个处理样品(n个=2）与每个未经治疗的患者进行比较(n个=2）一次，得到四组数据）。Zole是所有图中唑来膦酸盐的缩写

图2
唑来膦酸盐处理对HK-2细胞TGFβ1的影响。一不同浓度唑来膦酸处理下HK-2细胞中TGFβ1 mRNA的表达。b条唑来膦酸盐治疗后HK-2细胞中TGFβ1/SMAD3信号传导和纤维化标志物的蛋白质印迹分析。**c（c）**唑来膦酸钠与TGFβ1受体激动剂（TGFβ）或抑制剂（SB431542）治疗p-Smad3和纤维化因子蛋白表达的比较。d日唑来膦酸钠治疗诱导肾纤维化相关基因的相对mRNA水平。所有数据均以平均值±SD表示(n个=6）和^* *P（P）* < 0.05,^** *P（P）*<0.01和^*** *P（P）*分别与对照组相比<0.001

图3
唑来膦酸钠处理导致HK-2细胞中的脂质积聚。一代谢组数据的通路分析表明，FA代谢是受50µM唑来膦酸钠处理或不处理HK-2细胞影响的主要通路。b条,**c（c）**代谢组学数据中，与对照组相比，经50µM唑来膦酸盐处理的HK-2细胞中FA载体、共轭FA中间体、FA和脂质物种的代谢物升高。d日,**e（电子）**代表性TEM(*比例尺*2μm）和BODIPY染色(*比例尺*20μm）显示在50µm唑来膦酸盐处理的HK-2细胞中形成脂滴。**（f）**含或不含50µM唑来膦酸盐的HK-2细胞样品中的TG定量。克,小时以0、1、10、50µM剂量唑来膦酸盐处理48小时的HK-2细胞样本中与FAO相关的基因的相对mRNA或蛋白质水平。我唑来膦酸盐治疗降低了粮农组织的能力[¹⁴C] 棕榈酸酯氧化试验。j个,k与FA转运相关的基因相对mRNA和蛋白水平在用0、1、10、50µM剂量唑来膦酸盐处理48小时的HK-2细胞样本中。我唑来膦酸钠处理增加FA摄取能力[¹⁴C] 棕榈酸酯摄取测定

图4
唑来膦酸钠对小鼠肾脏毒性的影响及其相关分子途径。一与对照组相比，唑来膦酸钠治疗组小鼠的肌酐分泌减少。b条用H&E、PAS和ORO染色的唑来膦酸钠未治疗和治疗小鼠肾脏切片的代表性图像(*比例尺*1毫米）。**c（c）**马森三色染色的代表性图片(*比例尺*50μm）和I型胶原、Fn1和α-SMA IHC(*比例尺*20μm）用于检测唑来膦酸盐引起的肾损伤。d日对照和唑来膦酸盐治疗小鼠肾脏中TGFβ1/Smad3通路和纤维化标志物的蛋白质印迹分析。**e（电子）**对照组和唑来膦酸钠治疗小鼠中纤维化和肾脏损伤相关基因的相对转录水平。**（f）**典型凋亡和肾损伤因子的相对mRNA水平。克对照组和唑来膦酸盐处理组FAO相关基因的相对mRNA水平。小时对照组和唑来膦酸钠治疗组FA摄取相关转运体或载体的相对转录水平。我Slc27a2对照组和唑来膦酸钠治疗组小鼠肾脏的代表性IHC图像和western blot分析。(*比例尺*20微米）。每组有5只小鼠，在动物研究中接受4周的治疗

图5
唑来膦酸钠肾毒性的影响*Slc27a2公司*消融小鼠及其相关分子途径。一–**（f）**H&E染色的代表性显微照片(*比例尺*1 mm），ORO染色(*比例尺*1 mm），马森三色染色(*比例尺*50μm）和IHC图像(*比例尺*20μm）未经治疗的WT和*Slc27a2公司* ^−/−小鼠以及唑来膦酸钠治疗的WT和*Slc27a2公司* ^−/−个。克上述小鼠Fn1、I型胶原和α-SMA纤维化标记物的免疫印迹。小时上述样本中与肾纤维化和损伤相关的基因的相对mRNA水平。我未经处理和唑来膦酸盐处理的WT和*Slc27a2公司* ^−/−老鼠。j个Smad2/3 ChIPseq的轨迹*Slc27a2公司*小鼠胚胎干细胞（mESCs）和mESC衍生内皮细胞的基因位点。^# *P（P）*<*0.05,* ^## *P（P）* < *0.01*（唑来膦酸盐治疗与未治疗*Slc27a2公司* ^−/−小鼠）；^& *P（P）* < *0.05*（唑来膦酸盐处理*Slc27a2公司* ^−/−小鼠与经处理的WT小鼠）

图6
PPARA激动剂非诺布利奈对唑来膦酸相关肾毒性的影响。一对照小鼠、唑来膦酸钠治疗小鼠和唑来膦酸钠治疗的非诺贝特（Zole+fenofibrate）小鼠肾脏切片的H&E和ORO染色的代表性图像。(*比例尺*1毫米）。b条马森三色染色（标尺：50μm）和Fn1、I型胶原和α-SMA IHC的纤维化标记物(*比例尺*20μm）。**c（c）**上述三组小鼠肾纤维化标记物的Western blot分析。d日上述样本中与肾纤维化相关基因的相对mRNA水平。**e（电子）**上述小鼠中FAO相关基因的相对转录水平。^# *P（P）* < *0.05,* ^## *P（P）* < *0.01*，比较唑来膦酸钠治疗组或唑去膦酸盐+非诺贝特联合治疗组小鼠

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1. Chang JT，Green L，Beitz J.使用唑来膦酸导致肾衰竭。《新英格兰医学杂志》，2003年；349(17):1676–1678. doi:10.1056/NEJM200310233491721。-内政部-公共医学
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[1] Anderson CM，Stahl A.SLC27脂肪酸转运蛋白。Mol-Asp Med.2013；34(2–3):516–528. doi:10.1016/j.mam.2012.07.010。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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[3] Bergner R、Siegrist B、Gretz N、Pohlmeyer-Esch G、Kranzlin B。伊班膦酸盐和唑来膦酸钠对肾功能正常的Wistar大鼠和单侧肾切除术后的肾毒性。2015年药理学研究；99:16–22. doi:10.1016/j.phrs.2015.04.016。-内政部-公共医学

[4] Bergner R、Siegrist B、Gretz N、Pohlmeyer-Esch G、Kranzlin B。伊班膦酸盐和唑来膦酸钠对肾功能正常的Wistar大鼠和单侧肾切除术后的肾毒性。2015年药理学研究；99:16–22. doi:10.1016/j.phrs.2015.04.016。-内政部-公共医学

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[6] Bottinger EP，Bitzer M.TGF-β信号在肾脏疾病中的作用。《美国肾脏病杂志》。2002;13(10):2600–2610. 数字对象标识代码：10.1097/01.ASN.0000033611.79556.AE号.-内政部-公共医学

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