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.2017年8月31日；13（8）：e1006865。
doi:10.1371/journal.pgen.1006865。 eCollection 2017年8月。

WAGR综合征基因PRRG4是无连合轴突导向基因的功能同源物

伊丽莎白·D·正义 1, 莎拉·巴纳姆 1, 托马斯·基德 1
附属公司

WAGR综合征基因PRRG4是无连合轴突导向基因的功能同源物

伊丽莎白·D·正义等。 公共科学图书馆-基因. .

勘误表in

摘要

WAGR综合征的特征是威尔姆瘤、无尿症、泌尿生殖系统异常和智力残疾。WAGR是由包含PAX6、WT1和PRRG4基因的染色体缺失引起的。PRRG4被认为与WAGR综合征的孤独症症状有关，但PRRG4基因的分子功能尚不清楚。果蝇无连合（comm）基因编码一种短跨膜蛋白，其特征为PY基序，PRRG4蛋白具有这些特征。Comm拦截ER/Glgi中的Robo轴突导向受体，并将Robo作为降解目标，使连合轴突穿过CNS中线。人类Robo1在苍蝇中枢神经系统中的表达增加了中线交叉，PRRG4的共同表达增强了这一点，但CYYR、Shisa或酵母Rcr基因没有增强。在细胞培养实验中，PRRG4可以从细胞表面重新定位hRobo1，这表明PRRG4是Comm的功能同源物。Comm是苍蝇轴突引导和突触形成所必需的，因此PRRG4可能会干扰发育中的人脑中的这两个过程，从而导致WAGR的自闭症症状。

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数字

图1
图1。Comm、Rcr、PRRG和Shisa蛋白质的结构、结合伙伴和PY基序。
A类.潜在Comm同系物及其相互作用伙伴的示意图。果蝇属Comm1与Robo受体有物理联系[1]，但尚不清楚这种相互作用是直接的还是由其他蛋白质介导的。飞行机器人1的Comm1调节需要机器人1的跨膜域[62]。本研究预测了PRRG4和Robo受体之间的相互作用。Comm1的PY基序与Nedd4 E3泛素蛋白连接酶的WW结构域相互作用[9]。人类PRRG4蛋白的PY基序也与Nedd4的WW结构域相互作用[18]。与Nedd4的相互作用仅涉及Robo从细胞表面的内吞作用，而不涉及Robo胞吐的调节[10]。在酵母中，Rcr1和Rcr2蛋白调节氨基酸通透酶的细胞表面表达[38]，并且Rcr1通过细胞质PY基序与Rsp5泛素连接酶进行物理相互作用[37]。Shisa蛋白与成纤维细胞生长因子受体（FGFR）和Frizzled Wnt受体发生物理相互作用，阻止其运输到细胞表面[41]。Shisa蛋白由富含Cys的N末端结构域区分，这是CYYR1的共同特征[40]。B类候选Comm同源物细胞质域中富含脯氨酸（PY）基序的氨基酸比对。这些基序通常是PPxY或LPxY的形式，其中P是脯氨酸，Y是酪氨酸，L是亮氨酸，x是任何氨基酸。Comm1具有扩展的PY基序GLPSYDEAL，这对Comm1功能至关重要。核心LPxY基序以及保守的酸性和疏水性残基与PRRG蛋白共享。在PRRG蛋白中，PPxY基序出现在该扩展基序之后，而在无脊椎动物Comm蛋白中额外的PY基序发生在LPSY序列之前。除了主题之外，即使在其他昆虫物种中，保护率也非常低。用于排列的物种如下所示。
图2
图2。PRRG蛋白与Comm家族成员γ-羧基化结构域的比较。
A类。Comm1和PRRG4的域结构比较示意图。PRRG4具有Comm1中缺少的信号序列（SIG）（以及PRRG1和PRRG3）。γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）与前肽（PRO）结合，并以加工方式对谷氨酸残基进行修饰，通常先从相邻的或ω环或龙骨结构域（ω）开始，然后再进入含有多个谷氨酸残端的保守Gla结构域（Gla）。在PRRG4和Comm1的对齐中，ω和Gla域在Comm1中分离。还显示了跨膜结构域（TM）和PY基序。B类PRRG和Comm蛋白质胞外/管腔结构域的氨基酸比对。前肽中的关键残基是苯丙氨酸（F）、丙氨酸（A）和亮氨酸（L），位于相对于前肽蛋白水解裂解位点的-16、-10和-6位置（垂直箭头）。这些残基在果蝇属Comm1蛋白，在其他昆虫Comm蛋白中部分保守。ω-环含有谷氨酸（E）残基，两侧是保守的苯丙氨酸和亮氨酸残基，后者在整个Comm蛋白中都是保守的。C类Gla结构域的特征是谷氨酸残基的高频率以及保守的Cys和苯丙氨酸（Phe）残基。Comm1显示出与Gla结构域的弱同源性，因为苯丙氨酸和一对谷氨酸残基位于保守位置。在Comm1中，与Gla结构域对齐的区域对应于Keleman等人确定的对Comm1定位和功能至关重要的膜旁腔肽[10]。苯丙氨酸和谷氨酸残基存在于一些但并非所有昆虫Comm蛋白中。酵母Rcr蛋白缺乏Gla结构域，但与Comm1的同源性极为有限。在所有Comm蛋白以及PRRG3和PRRG4中，跨膜结构域的细胞质末端附近都存在一个保守的Cys，这两种蛋白都可以在细胞培养中调节Robo（尽管PRRG3中存在部分）。用于提供路线序列的物种显示在底部。
图3
图3。酵母Rcr蛋白的轴突定位。
已解剖果蝇属用Nomarksi或微分干涉（DIC）显微镜对胚胎神经索进行成像，使未染色的轴突可见。中枢神经系统轴突支架形成一个典型的阶梯状结构，位于组成神经索的细胞体顶部。对于错误表达实验sca-GAL4型将泛神经驱动程序与所示UAS转基因的单个拷贝相结合（B-D）.A类.dRobo1蛋白主要定位于纵向轴突束（箭头），在穿过CNS中线的连合处（箭头）染色较少。运动神经根的轴突也有标记（星号）。B类表位标记酵母Rcr1在中枢神经系统轴突中的表达。在下面的细胞体中有一些染色，但与连合（箭头）相比，纵向轴突束（箭头）中的表达明显更强。运动神经根显示出强烈的轴突定位（星号）。C类酵母Rcr2的轴突染色很轻，在下面的细胞体中表达更强（箭头、箭头）。神经根有微弱的染色（星号）。D类.PRRG4蛋白的表达仅限于细胞体，在轴突中不存在。轴突中可能存在微量PRRG4蛋白，但轴突可见的主要原因是DIC显微镜检查。细胞体的表达在连合（箭头）下方最为明显，但也在纵向束的外侧（箭头）。神经根缺乏可检测的PRRG4表达（星号）。
图4
图4。PRRG4与人类Robo1在果蝇属腹神经索。
已解剖果蝇属用单克隆抗体BP102染色的胚胎腹神经索可染色中枢神经系统轴突支架(A-E公司)，或反dRobo1 13C9(F-I公司)或反脊椎动物机器人1(J型). 两个污点都是棕色的。对于过度表达实验扫描-凝胶4存在泛神经驱动器和指示的UAS转基因（B-D、G、I）.A类16期胚胎的野生型轴突支架显示出穿过中枢神经系统中线（箭头）的连合和沿身体前后轴突出的纵向束的规则排列（箭头）。每个节段的前后连合被中线胶质细胞和运动神经元（星号）的胞体分开。B类PRRG4的泛神经元表达导致无法完全分离连合，导致连合（箭头）的模糊外观。C类人类Robo1的泛神经表达导致轴突支架在某些节段的中线部分塌陷（箭头所示）。在其他节段中，连合看起来更厚（箭头），在一些节段中即使连合保持分离（星号），轴突支架的宽度也会减小。D类PRRG4和hRobo1的共同表达导致强烈的轴突表型，包括轴突以类似的方式折叠到中线狭缝突变体（箭头），模糊且未分离的连合，纵骨中断（箭头）或模糊且仅部分分离连合（星号）。E类γ-谷氨酰羧化酶基因（GC）无突变的16期胚胎纯合子。轴突支架未发现任何缺陷。F类.第13阶段野生型胚胎苍蝇Robo1蛋白染色。轴突支架的纵向部分呈棕色（箭头），但连合处缺乏Robo1蛋白（箭头）。神经胶质中线的迁移使连合开始分离。G公司PRRG4和hRobo1的泛神经表达导致Robo1蛋白进入连合（箭头），这是当通信表达过度。H（H）14期野生型胚胎，连合分离，但缺乏可见的Robo1染色（箭头）。纵束有Robo1染色（箭头）。我表达PRRG4和hRobo1的胚胎在连合（箭头）中显示Robo1蛋白。表达PRRG4和hRobo1的表型效应可以在染色的不对称性和支架宽度的横向减少中看到（星号）。J型.具有泛素表达的胚胎UAS-h机器人1使用刮痕-GAL4司机被防机器人1（Abcam ab7279）染色。人类Robo1蛋白在连合轴突（箭头）中可见，表明hRobo1不受飞行通信的调节。数据汇总在表1中，基本数据显示在S1数据中。
图5
图5。Comm、PRRG和Robo蛋白的共定标。
如图面板所示，用表位标记的构建物转染COS细胞。通过抗体标记和荧光显微镜检测蛋白表达。DAPI（蓝色）染色检测细胞核。A类细胞转染了Comm和rRobo1。尽管存在大量的Comm蛋白（绿色），rRobo1仍然定位于细胞表面和整个细胞（品红色），这表明这些蛋白在本试验中不相互作用。细胞内Comm和rRobo1表达的重叠程度非常有限（白色；a*中的箭头），但在大多数其他区域也明显缺乏重叠。B类PRRG4和dRobo1。在这张图片中，两个细胞被dRobo1（洋红色）转染，但只有一个细胞表达高水平的PRRG4（绿色）。对这两个细胞的比较表明，在PRRG4（箭头）水平较低的细胞中，dRobo1的模式与表达PRRG4的细胞几乎没有差异，表明这两种蛋白没有相互作用。放大面板（B*）中几乎看不到重叠（白色）。C类当共同表达时，.PRRG1和rRobo1在推测的ER/Glgi中显示出轻微的共同定位（白色区域，C“'和C*中的箭头）。在不靠近细胞核的区域，可以看到这两种蛋白质的强烈分离（C*中的箭头），表明它们没有相互作用。D类PRRG2和rRobo1的共同表达导致蛋白质很少或没有共同定位。E类。PRRG3的表达可导致细胞表面（E“）上rRobo1的减少和细胞核周围有限的共定位（E*中的箭头）。然而，这两种蛋白质并没有在细胞的许多部分共存（E*中的箭头）。这些结果表明，PRRG3可能具有有限的相互作用能力。F类PRRG4和rRobo1的共同表达导致细胞表面rRobo2（F“）的强烈减少，并导致这两种蛋白质在整个细胞中的共同定位，尤其是在靠近细胞核的推测ER/高尔基体中（F*中的箭头）。相邻单元格表达高水平的PRRG4和低水平的rRobo1（F“和F”'中的箭头），这表明PRRG4可能导致rRobo2退化。这些结果强烈表明，PRRG4和rRobo1在细胞培养中相互作用。
图6
图6。PRRG4从质膜重新放大rRobo1。
用编码面板中所示基因的质粒转染COS细胞，并用洋红抗Robo抗体染色。用DAPI（蓝色）对细胞进行复染，以显示细胞核。A类.果蝇属机器人1（dRobo1）和B类dRobo1和Comm的共同表达导致dRobo1从细胞表面重新定位到ER/高尔基体。C类.再定标实验结果的量化。将转染有所示基因的细胞染色为dRobo1或rRobo1。亚细胞定位在质膜上或主要在内质网/高尔基体上由一名对存在的质粒视而不见的实验者进行评分。根据核染色判断，每个类别至少有22个健康细胞被评分。ER/Glgi定位的细胞百分比如条形图所示。误差条是反映采样噪声的95%置信区间。显示了与dRobo1和rRobo1对照组相关的统计显著性（***p<0.01，具有高度统计显著性），并使用双尾Fisher精确检验进行了计算。对于PRRG和rRobo1，采用了Bonferroni校正。带有和不带Comm的dRobo1的比较p值<0.0001。rRobo1和PRRG4的比较p<0.0001。PRRG3和rRobo1数据趋于统计显著性，p=0.0538（截止值为p<0.0125）。D类存在PRRG1的.rRobo1主要局限于细胞表面。E类PRRG2和rRobo1的共同表达导致rRobo2的细胞表面定位。F类.PRRG3表达可导致细胞表面rRobo1的水平降低。G公司。大多数共表达PRRG4和rRobo1的细胞对rRobo2显示ER/Glgi定位。S2数据中显示了基础数据。
图7
图7。PRRG4降低COS细胞中rRobo1蛋白水平。
用编码rRobo1或hDscam和增加PRRG4数量的质粒转染COS细胞。A类。在存在不同数量PRRG4的情况下，对hDscam和rRobo1蛋白水平进行免疫印迹分析。大鼠Robo1蛋白水平随着PRRG4质粒数量的增加而下降，而hDscam水平保持相对恒定。B类.独立免疫印迹实验的量化。使用ImageJ定量hDscam和rRobo1的蛋白带密度。阳性对照是在没有PRRG4质粒的情况下转染每个质粒，密度值设置为1。每个实验的所有其他值都表示为相对于对照的值，以便在不同的实验中进行归一化。采用Fisher LSD检验进行单因素方差分析。星号代表hDscam和rRobo1之间差异的p值，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。对于120ng的PRRG4，差异无统计学意义（p=0.05118），但明显趋于显著。250ng PRRG4的效果非常强且可重复（p=0.00002）。误差条表示标准误差，并被虚线rRobo1线的250ng PRRG4数据点遮挡。基础数据显示在S3数据中。
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中的注释

  • PRRG4功能揭示了机器人贩运在进化上是保守的。
    伯尼·J·。 伯尼·J·。 公共科学图书馆-遗传学。2017年8月31日；13（8）：e1006927。doi:10.1371/journal.pgen.1006927。eCollection 2017年8月。 公共科学图书馆-遗传学。2017 PMID：28859080 免费PMC文章。 没有可用的摘要。

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