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.2017年8月30日；8(1):386.
doi:10.1038/s41467-017-00540-5。

ATRX是治疗诱导人类细胞衰老的调节器

马尔塔·科瓦切娃 1 2, Will Liao（威尔·廖） 三, 玛丽·E·克莱恩 1 2, 尼古拉斯·罗宾 三, 希瑟·盖革 三, Aimee M Crago公司 2 4, 马克·A·迪克森 5 6, 威廉·D·塔普 5 6, 塞缪尔·辛格 4, 安德鲁·科夫 7 8
附属公司

ATRX是治疗诱导人类细胞衰老的调节器

马尔塔·科瓦切娃等。 国家公社. .

摘要

衰老是一种稳定的细胞周期退出状态，对发育和疾病具有重要意义。在这里，我们证明染色质重塑酶ATRX是治疗性衰老所必需的。ATRX在核病灶中积累，并在暴露于DNA损伤剂或CDK4抑制剂的多种类型转化细胞中用于治疗诱导的衰老。转移到病灶取决于ATRX与H3K9me3组蛋白和HP1相互作用的能力。在细胞退出细胞周期后，在其他衰老标志出现之前，病灶很快形成。消除衰老细胞中的ATRX会破坏衰老相关异色病灶的稳定性。此外，ATRX结合并抑制HRAS基因座的表达；抑制HRAS足以促进静止细胞向衰老过渡，并阻止抑制阻止衰老的进展。因此，ATRX是治疗诱导衰老的关键调节器，并以多种方式驱动细胞进入这种状态。治疗诱导衰老（TIS）是一种由某些癌细胞中的细胞抑制剂激活的生长抑制程序。在这里，作者表明染色质重塑酶ATRX是TIS的调节器，并通过多种机制驱动细胞进入这种状态。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1
ATRX对于阿霉素诱导的衰老是必要的。LS8817细胞用打乱的（shSCR）或ATRX特异性（shATRX）慢病毒敲除载体转导，然后用100 nM阿霉素治疗7天。一从每条泳道上方所示的细胞中提取提取物，并通过免疫印迹法测定蛋白质的表达，如左边每个面板的。用D-5抗体检测ATRX。b条细胞按照左边并用上面显示的抗体染色顶部每个面板的。显示了具有代表性的图像(顶部)并绘制病灶的量化图(底部).c（c）在第0天对显示的细胞进行电镀，并用100 nM阿霉素（doxo）或未经治疗（CTRL）。计算指定日期的细胞数，并绘制相对细胞数。d日,e（电子）SA-β-gal阳性细胞的积聚(d日)或SAHF阳性细胞(e（电子）)对每个单独的治疗条件进行测量。显示了具有代表性的SAHF图像(在下面).如果在每种指示条件下，用qPCR测定脂肪肉瘤SASP转录物中四个转录物的积累，绘制并比较阿霉素处理细胞与未处理细胞中它们的诱导。克细胞用100 nM阿霉素（7D阿霉素）或不治疗（CTRL）7天。然后收集、计数细胞，并在无药物的情况下以低密度重新放置。3周后用结晶紫染色法检测克隆生长。显示了两个独立实验的代表性图像。由于无法识别单个菌落，因此未量化菌落数。所有数据均绘制为平均值 ± 至少三个独立实验的SEM。星号表示第页 < 0.05使用双面学生t吨-测试。所有图像均在相同的放大倍数下拍摄。这个比例尺为20微米。参见补充图10了解未截取的斑点
图2
图2
ATRX在与HP1γ-SAHF共定位的衰老细胞的核病灶中积累。一LS8817细胞用PD0332991处理指定天数，固定并随后用ATRX抗体染色。计算并绘制每个细胞中ATRX病灶的数量（每张图>150个细胞）。具有多个病灶的细胞百分比显示在年-轴。b条用PD0332991处理LS8817细胞7天，HP1γ(左边)或PML焦点(正确的)用免疫荧光法测定ATRX病灶。显示了具有代表性的图像。在对照细胞和处理细胞中，ATRX病灶与HP1γ或PML病灶共定位的比例被量化。圈子在维恩图中，绘制的是相对于每种情况下指示焦点数量的比例。c（c）如前所述，用PD0332991治疗所示脂肪肉瘤细胞系7天。表明了这种治疗对静止或衰老的效果。通过免疫荧光检测ATRX病灶，并绘制每个细胞的平均病灶数(正确的). 代表性图像显示在左边所有数据均表示为平均值 ± 至少3个独立实验的SEM。星号表示第页 < 0.05使用双面学生t吨-测试。所有图像均在相同的放大倍数下拍摄。这个比例尺为20微米
图3
图3
ATRX支持CDK4i诱导U2OS细胞衰老的能力需要HP1和H3K9me3结合位点。一ATRX示意图显示了UniProt上标注的域和氨基酸残基。箭头指出用于确认突变的配对测序引物。b条–d日用表达野生型或突变型ATRX等位基因的载体转染U2OS细胞，用G418筛选稳定的转化子，并按方法所述进行分类，以恢复GFP-low群体。WT表示野生型。b条在图2图例中描述的突变体中进行ATRX免疫荧光。绘制了每个细胞的ATRX焦距平均数，并显示了代表性图像。c（c）PD0332991（PD）治疗7天后，对SA-β-gal阳性细胞的积聚进行评分。星号表示第页 < 与表达野生型ATRX的细胞相比，治疗后SA-β-gal的诱导作用为0.05。第页-使用双面学生的t吨-测试。d日用A301-045A抗体检测ATRX。Tubulin是一种负载控制。e（电子）在PD0332991（PD）治疗7天前后，在表达不同突变ATRX结构的U2OS细胞中检测Rb磷酸化，这是一种细胞增殖的测量。Tubulin是一种负载控制。所有数据均表示为平均值 ± 至少两个独立实验的SEM。参见补充图10了解未截取的斑点。所有图像均在相同的放大倍数下拍摄。这个比例尺为20微米
图4
图4
在衰老细胞中维持HP1γSAHF需要ATRX。一按所述处理LS8817细胞。b条–d日然后固定细胞，ATRX病灶数量(b条)，SA-β-gal阳性细胞的积累(c（c）)以及SASP细胞因子程序的四个mRNA的积累(d日)进行了测量。e（电子）在缺乏药物的情况下以低密度替换细胞后，评估克隆生长。由于无法识别单个菌落，因此未量化菌落数。如果测定HP1γ阳性细胞（SAHF）的积累。显示了具有代表性的图像(左边)SAHF阳性细胞的百分比被量化(正确的).克 人力资源管理系统用qPCR分析mRNA水平。所有数据均表示为平均值 ± 来自至少三个独立实验的SEM。星号表示第页 < 0.05使用双面学生t吨-测试。所有图像均在相同的放大倍数下拍摄。这个比例尺为20微米
图5
图5
ATRX影响衰老细胞中E2F和EZH2靶基因的表达。一基于RNA-seq测序的所有RNA表达的层次聚类。每行代表一个样本，条件如上所示；在每种情况下重复进行RNA-seq。b条维恩图显示了差异表达的基因数量，其倍数变化至少为−1.8或1.8，且FDR为 < 在未扰动和ATRX缺乏的LS8817细胞中，经PD-处理的样品与对照样品之间的差异为0.05；指出了在这两种细胞类型中发现的共同基因。c（c）丰富分析调控上调和下调基因列表的顶级预测转录因子b条。的负日志第页-绘制了浓缩分数的值。d日对未受干扰和ATRX缺乏的LS8817细胞中经PD-处理的样本与对照样本进行基因集富集分析（GSEA），具体分析E2F4和EZH2基因特征。剖面图显示了相应的归一化富集分数（NES）和FWER第页-值
图6
图6
ATRX直接结合并抑制人力资源管理系统以响应CDK4的抑制。一维恩图显示了未经治疗（循环）的LS8817细胞、经PD0332991处理7天（CDK4i）或阿霉素处理7天的衰老LS8817电池和经低血清中生长5天（0.5%血清饥饿）诱导的静止细胞中通过ChIP序列确定的ATRX特异性峰数。b条饼图总结了166个衰老特异性顶点在基因体内的分布，与启动子或基因间区域相关。c（c）对调控“基因体”和“启动子”相关基因的顶级预测转录因子的丰富分析b条.d日衰老过程中指示基因表达下调(左边)或衰老时上调(正确的)在用CDK4i处理的细胞系中，通过qPCR进行测量，并绘制出处理（7天）细胞与未处理细胞（归一化为β-actin）相比的倍变化。虚线以1.8倍的变化绘制。e（电子）,如果在调控ATRX水平的指定细胞系中测量指定基因的表达(e（电子），LS8817；如果，U2OS）。克在未经处理的对照组和PD0332991处理的细胞中进行ATRX ChIP实验，并用qPCR分析ATRX在指定位点的相对结合。小时在指定时间用PD0332991处理LS8817细胞并在人力资源管理系统通过qPCR确定了该位点。我ATRX富集的基因组浏览器视图人力资源管理系统不同生长条件下的位点。这个红色条下面的轨迹表示IDR算法调用的峰值。绿色条表示预测将形成G-四联体结构的序列。蓝色盒子代表的外显子结构人力资源管理系统图是从两个生物ChIP-seq复制品中的一个获得的，但具有代表性。j个ATRX从CDK4抑制剂处理和未处理的U2OS细胞中免疫沉淀，其中野生型（WT）或突变蛋白表达，并在人力资源管理系统qPCR测定位点。k个 人力资源管理系统在图3所示的细胞中测量mRNA水平。所有数据均表示为平均值 ± 至少两个独立实验的SEM。星号表示第页 < 0.05使用双面学生t吨-测试
图7
图7
稳定人力资源管理系统表达阻止从静止到衰老的转变。一–小时野生型人力资源管理系统（HRASwt）或载体控制（vect）在LS8817中稳定表达。用嘌呤霉素筛选4天后，用1 μM的PD0332991，持续7天（7D PD），并与循环（CTRL）细胞进行比较，分析如下：人力资源管理系统用qPCR测定mRNA水平(一)，BrdU公司阻止增长(b条)和细胞周期蛋白A免疫印迹(c（c）)，SA-β-加仑(d日)，HP1γSAHF(e（电子）)，单个ATRX焦点的数量(如果)qPCR测定的四种SASP因子的诱导(克)一旦挖出的洞被移除，PD0332991就会恢复细胞周期(小时). 面板e下方显示了具有代表性的SAHF图像。面板h中的菌落形成未量化，因为无法区分单个菌落。给出了单个实验，所有数据均表示为平均值 ± SEM从三个独立的角度来看。Asrteresk公司表示第页 < 0.05使用双面学生t吨-测试。所有图像都是以相同的放大倍数拍摄的。这个比例尺为20微米。参见补充图10了解未截取的斑点
图8
图8
减少人力资源管理系统这种表达可以促使静止的细胞衰老。一 人力资源管理系统在循环LS8817细胞中用两个独立的发夹稳定击倒，并用qPCR测定转录水平。所示基因在shSCR细胞中的表达水平分别归一化为1。b条–e（电子）LS8817细胞被血清饥饿3天，随后感染了指示的shRNA编码慢病毒。经过额外5天的选择人力资源管理系统信使核糖核酸(b条)，SA-β-加仑(c（c）)和SAHF(d日)进行了测量。显示了具有代表性的SAHF图像(e（电子）). 细胞在完全培养基中重新培养3周后，用结晶紫染色法检测菌落的长期克隆形成性。显示了具有代表性的图像(左边)菌落数量被量化(正确的). 所有数据均表示为平均值 ± 三个独立实验的SEM。星号表示第页 < 0.05使用双面学生t吨-测试。所有图像均在相同的放大倍数下拍摄。这个比例尺为20微米
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