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.2017年8月25日5:5:e3627。
doi:10.7717/peerj.3627。 2017年电子收集。

肺癌细胞在放射治疗中分泌的胞外小泡通过转移miR-23a促进内皮细胞血管生成

郑永发 # 1, 梁刘 2, 陈聪 1, 平埔明 三, 秦晃 1, 李长虎 1, 曹德东 1, 徐希明（Ximing Xu） 1, 魏戈 # 1
附属公司

肺癌细胞在放射治疗中分泌的胞外小泡通过转移miR-23a促进内皮细胞血管生成

郑永发等。 同行J. .

摘要

血管生成是导致肺癌放射抗性的重要因素。然而，放射治疗诱导血管生成的相关机制尚不清楚。在这里，我们证明了来源于体外培养细胞的细胞外囊泡（EV）可以促进HUVEC的增殖和迁移，并且当HUVECs被来源于两种肺癌细胞系A549或H1299的EV处理时，增强效果更加明显。此外，当肺癌细胞受到X射线照射时，EV诱导的促血管生成作用可以增强。此外，我们证实了PTEN的下调在这一过程中起着至关重要的作用。通过评估EV中靶向PTEN的microRNAs（miRNAs）水平的变化，我们发现miR-23a显著上调并介导PTEN的减少。荧光素酶报告基因转移实验表明，PTEN是miR-23a的直接靶点，PTEN表达动力学与miR-23a相反。我们的结果表明，miR-23a/PTEN通路在EV诱导的血管生成中起着重要作用。这些发现表明miR-23a/PTEN轴是肺癌放射治疗的新靶点。

关键词：血管生成；电动汽车；肺癌细胞；放射治疗；miR-23a。

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利益冲突声明

作者们声明没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1。电动汽车的特性。
（A） 从A549条件培养基中分离出的EV的电子显微照片。箭头表示电动汽车。比例尺：200 nm。（B） 在EV中检测到CD63表达。以EVs裂解物、A549细胞作为阳性对照，以培养基作为阴性对照进行Western blotting。（C） HUVEC与PKH-26标记的EV孵育（PKH-26以黄色显示），在HUVECs中观察到EV的摄取。内皮细胞核用DAPI（蓝色）染色。箭头表示内皮细胞内标记PKH-26的EV。比例尺：50µm。
图2
图2。肺癌细胞衍生EV增强HUVEC的增殖。
（A–J）HUVEC与来自不同细胞的EV孵育指定时间。细胞为HEK293、A549和A549，暴露于4Gy X射线照射，H1299和H1299暴露于4gy X射线辐照。（A，B）进行CCK8测定以评估EVs对内皮细胞增殖的影响。（C，D）用EdU标记增殖的HUVEC。点击反应显示EdU染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。图像是结果的代表。（E，F）用所示EVs处理的细胞的Ki67免疫荧光，代表增殖细胞的Ki65显示为绿色，内皮细胞的细胞核用DAPI（蓝色）染色。图像是结果的代表。（G，H）量化来自（C，D）的数据，以EdU染色的细胞百分比表示。数据表示为HEK293衍生电动汽车治疗过程中的折叠变化。（I，J）（G，H）数据的量化，以Ki-67染色的细胞百分比表示。数据表示为HEK293衍生电动汽车治疗过程中的折叠变化。*，P（P）<0.05，与HEK293衍生EV的治疗相比。*#：P（P）与未照射A549或H1299衍生EV的治疗相比，<0.05。
图3
图3。肺癌细胞衍生EV增强HUVEC的迁移。
（A–F）HUVEC与来自不同细胞的EV孵育指定时间。这些细胞是HEK293、A549或A549暴露于4Gy X射线照射，H1299或H1299暴露于4gy X射线辐照。（A，B）不同来源EV孵育的HUVEC伤口愈合试验。（C，D）不同来源EV孵育的HUVEC的Transwell分析。图像是结果的代表。（E，F）量化来自（C，D）的数据。∗, P（P）与HEK293衍生EV的治疗相比，<0.05。∗#以下为：P（P）与未照射A549或H1299衍生EV的治疗相比，<0.05。
图4
图4。PTEN的下调在EV诱导的内皮细胞增殖和迁移中起着关键作用。
HUVEC与来自不同细胞的EV孵育指定时间。受4Gy X射线照射的细胞为HEK293、A549和A549。（A） 在用指示的EVs处理细胞后，使用qRT-PCR评估PTEN的mRNA水平。数据表示为使用HEK293衍生EV处理的HUVEC的折叠变化。∗, P（P）与HEK293衍生EV治疗相比，<0.05。∗#:P（P）与未照射A549或H1299衍生EV的治疗相比，<0.05。（B，C）用指示的EV治疗HUVEC。然后，以GAPDH为负荷对照，用western blotting检测PTEN（B）或p-AKT和p-ERK（C）的蛋白水平。
图5
图5。转移的miR-23a介导EV诱导的HUVEC PTEN下调。
（A） 用指示的EV处理后，用qRT-PCR评估与靶向PTEN的miRNAs相对应的HUVEC的mRNA水平。数据表示为未经X射线照射的A549细胞经EV处理的HUVEC的折叠变化。（B） 在4次X射线照射后，分离A549细胞的EV，并用qRT-PCR评估靶向PTEN的miRNAs水平。（C） 在暴露于4次X射线照射后，使用qRT-PCR评估A549细胞中靶向PTEN的miRNAs水平。（D） 人类PTEN mRNA 3′-UTR中miR-23a预测结合位点的示意图。（E）用miR-23a-mimics或抑制剂转染A549细胞时，天然miR-23a的折叠变化，用qRT-PCR检测。（F） 用qRT-PCR检测miR-23a模拟物或抑制剂转染A549细胞时PTEN mRNA的折叠变化。（G） 通过将野生型PTEN-WT-3′-UTR载体或PTEN-突变体-3′-UTR载体与miR-23a模拟物或阴性对照物共转染24 h，在HEK293细胞中进行荧光素酶报告试验，miR-23a模拟物显著抑制野生型报告者的荧光素酶活性，但对突变型报告者影响最小。∗, P（P） < 0.05.
图6
图6。转移的miR-23a介导EV诱导的HUVEC增殖和迁移。
（A–B）在暴露于4次X射线照射后，使用和不使用miR-23a抑制剂，用qRT-PCR评估A549细胞中天然miR-23a的水平。（B） 在接受4次X射线照射后，分别在有和无miR-23a抑制剂的情况下，分离A549细胞的EV，并用qRT-PCR评估miR-23a的水平。∗, P（P） < 0.05. 与对照组相比。∗#:P（P）与4Gy（C–H）相比，<0.05。在暴露于4次X射线照射后，使用和不使用miR-23a抑制剂，分离EV并与HUVEC孵育。（C） 用qRT-PCR检测人脐静脉内皮细胞PTEN mRNA水平。（D） 用免疫印迹法检测PTEN p-AKT和p-ERK的蛋白水平，以GAPDH作为负荷对照。（E） 采用CCK8法评估EVs对内皮细胞增殖的影响。（F） 用不同来源的EV孵育的HUVECs的伤口愈合测定。（G） 不同来源EV孵育的HUVEC的Transwell分析。图像是结果的代表。（H） 量化（G）中的数据。∗, P（P） < 0.05. 与控制电动汽车相比。∗#:P（P）与4 Gy+NC EV相比，<0.05。
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赠款和资金

本研究得到了国家自然科学基金重点项目（编号：30970860和81272500）的资助。武汉大学独立研究项目（编号：2042017kf0136）提供了额外资金。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。