Inhibition of ROCK1 kinase modulates both tumor cells and stromal fibroblasts in pancreatic cancer

doi:10.1371/journal.pone.0183871

.2017年8月25日；12（8）：e0183871。

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抑制ROCK1激酶对胰腺癌肿瘤细胞和基质成纤维细胞的调节

克利福德·J·沃特科特¹, 塞里纳Ng¹, 迈克尔·T·巴雷特², 盖伦·霍斯特³, 丹尼尔·冯·霍夫¹, 韩海勇¹

附属公司

¹美国亚利桑那州凤凰城转化基因组研究所分子医学部。
²美国亚利桑那州斯科茨代尔市梅奥诊所癌症中心。
³美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所分析病理学实验室。

PMID： 28841710
预防性维修识别码： PMC5571985
内政部： 10.1371/journal.pone.0183871

抑制ROCK1激酶对胰腺癌肿瘤细胞和基质成纤维细胞的调节

克利福德·J·沃特科特等。公共科学图书馆一号. 2017.

.2017年8月25日；12（8）：e0183871。

doi:10.1371/journal.pone.0183871。 2017年电子收集。

作者

克利福德·J·沃特科特¹, Serina Ng女士¹, 迈克尔·T·巴雷特², 盖伦·霍斯特³, 丹尼尔·冯·霍夫¹, 韩海勇¹

附属公司

¹美国亚利桑那州凤凰城转化基因组研究所分子医学部。
²美国亚利桑那州斯科茨代尔市梅奥诊所癌症中心。
³美利坚合众国密歇根州大急流城范安德尔研究所分析病理学实验室。

PMID： 28841710
预防性维修识别码： PMC5571985
内政部： 10.1371/journal.pone.0183871

摘要

ROCK，或Rho-相关螺旋卷曲蛋白激酶，是AGC激酶家族的成员，已被证明在细胞迁移、ECM合成、应力纤维组装和细胞收缩中发挥作用。据报道，ROCK在多种病理条件下表达增加，包括癌症。在这里，我们报告了ROCK 1在胰腺癌上皮细胞以及癌相关成纤维细胞（CAF）中的表达增加。在我们的分析中，通过IHC分析，62%的肿瘤样本的染色强度≥2+，而相邻的正常组织样本为40%（P<0.0001）。因此，我们假设ROCKs可能在胰腺癌的进展中发挥重要作用，并可能作为合适的治疗靶点。我们通过CGH分析报告了胰腺导管腺癌（PDAC）患者组织样本中18q11.1号染色体上ROCK1基因位点的低频（4/34）扩增。小分子抑制剂（fasudil）对ROCK激酶活性的抑制导致PDAC细胞增殖、迁移和共同培养的星状细胞活化的中度抑制（6～71μM的IC50s）。在KPC小鼠胰腺癌模型中，法舒地尔降低了肿瘤胶原沉积。这意味着小鼠的总体存活率提高，吉西他滨摄取量增加。虽然法舒地尔可能同时作用于肿瘤上皮细胞和CAF，但我们的研究结果与抑制肿瘤基质增强药物在PDAC中的渗透和疗效的假设一致。总的来说，我们的数据表明ROCK1可能是一个潜在的治疗靶点，可以增强胰腺癌的现有治疗方案。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。PDAC组织中ROCK1蛋白表达和基因扩增。**
A）正常胰腺切片（阴性染色）和PDAC组织切片（强染色，分数为3+）中ROCK1蛋白的免疫染色。黑色箭头：肿瘤细胞；椭圆箭头：癌相关成纤维细胞。B）来自一名具有局灶性（1.76Mb）18q11.1扩增子的代表性患者的全基因组（底部面板）、18号染色体（中间面板）和ROCK1基因位点（顶部面板）的aCGH图。蓝色阴影区域表示由ADM2阶跃图算法[31]定义的异常拷贝数间隔，并带有日志₂含有扩增子的ROCK1的比率为+1.4（p<0.001）。

**图2。胰腺癌细胞中siRNA敲低ROCK1抑制细胞增殖。**
A）通过Western blotting在胰腺癌细胞系（PANC-1、Mia PaCa-2、SU.86.86、BxPC3、AsPC-1和HS766T）、永生正常胰腺导管上皮细胞系（HPDE6）和癌相关成纤维细胞（CW-1）中检测到ROCK1。B）在72小时内通过siRNA敲低ROCK1的蛋白质印迹分析。（C）两种细胞系SU.86.86和PANC-1中siRNA敲低ROCK1的Western blotting分析（72小时处理）。（D）经siRNA至ROCK1.*处理的胰腺癌细胞（PANC-1和SU.86.86）的生长曲线P<0.001（与未经治疗的对照组相比）。UT，未经处理；tR，仅转染试剂；NT，非目标；ASD，细胞死亡（阳性）对照；R1，ROCK1 siRNA1；R2，ROCK1 siRNA 2。

**图3。抑制ROCK1对胰腺癌细胞和癌相关成纤维细胞的影响。**
A）胰腺癌细胞治疗72小时后的Fasudil剂量-反应曲线。B） ROCK1 siRNA处理细胞中的肿瘤细胞迁移。C）法舒地尔治疗的共培养胰腺癌细胞和癌相关成纤维细胞的荧光显微镜分析。用法舒地尔处理细胞48小时，然后进行α-SMA（红色）、胶原蛋白I（绿色）和DNA（蓝色）染色。D）法舒地尔处理CAF的荧光显微镜分析。E）采集经Fasudil处理、单培养和共培养的胰腺癌细胞和癌相关成纤维细胞，并在非变性条件下通过免疫印迹（斑点印迹）分析胶原蛋白I的表达。

**图4。法舒地尔治疗对KPC小鼠肿瘤基质的影响。**
A）从载体、吉西他滨或吉西他宾与法舒地尔联合治疗的KPC小鼠的胰腺肿瘤组织中采集并染色以检测各种基质标记物。H&E染色、α-SMA、Desmin、CD31、胶原蛋白I和Movat五色染色的代表性图像。

**图5。吉西他滨和法舒地尔治疗对PDAC KPC模型的影响。**
A）采集胰腺组织并进行CD31染色，每20倍视野分析阳性染色。B）在多个深度切割小鼠肝脏切片，以评估载体、吉西他滨和吉西他滨加法舒地尔治疗的组织中是否存在转移性病变。法舒地尔还增强了吉西他滨对KPC小鼠的肿瘤生长抑制活性。在一（C）或两（D）个12天治疗周期前后，通过超声对荷瘤KPC小鼠进行三维体积测量。显示基线的百分比变化。上皮肿瘤细胞中增殖标志物Ki67（E）和凋亡标志物裂解的胱天蛋白酶3（CC3）（F）的IHC分析也显示了在各种治疗队列中治疗的小鼠。Fasudil提高了荷瘤KPC小鼠的生存率。G）用载体、吉西他滨或吉西他宾与法舒地尔联合治疗的KPC小鼠的Kaplan-Meier曲线。与仅吉西他滨组相比，联合治疗可显著提高总生存率（对数秩P值=0.038）。H）在注射吉西他滨之前，用载体或法舒地尔治疗三天的小鼠胰腺组织，分析肿瘤组织中的单磷酸吉西他宾浓度。*P<0.05。**P<0.01。

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