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.2017年8月25日：6:e28046。
doi:10.7554/eLife.28046。

分裂酵母性别分化的泛素依赖性控制

法布里齐奥·西蒙内蒂 1 2, 蒂托·坎德利 1 2, 塞巴斯蒂安·莱昂 三, 多梅尼科·利布里 1, 马修·罗杰梅尔 1
附属公司

分裂酵母性别分化的泛素依赖性控制

法布里齐奥·西蒙内蒂等。 埃利夫. .

摘要

在裂变酵母中，减数分裂特异性转录物在营养生长期间通过YTH家族RNA-结合蛋白Mmi1和核外体的联合作用被选择性地消除。在营养饥饿时，减数分裂的主调节因子Mei2使Mmi1失活，从而允许减数分裂程序的表达。这里，我们表明进化上保守的Ccr4-Not复合体的E3泛素连接酶亚单位Not4/Mot2与Mmi1相关，促进有丝分裂细胞减数分裂转录物表达的抑制。我们的分析表明，Mot2引导Mei2的泛素化，以在营养生长期间保持Mmi1的活性。重要的是，Mot2不参与Mei2周转的组成途径，而是发挥调节作用，限制其积累或抑制其功能。我们建议Mmi1招募Ccr4-Not complex来对抗其自身的抑制剂Mei2，从而将系统锁定在稳定状态，确保Mmi1抑制减数分裂程序。

关键词：Ccr4-不复杂；RNA降解；蓬贝沙门菌；YTH家族RNA-结合蛋白Mmi1；染色体；分裂酵母性分化；基因；减数分裂诱导子Mei2；蛋白质泛素化。

PubMed免责声明

利益冲突声明

没有宣布竞争利益。

数字

图1。
图1：RNA-结合蛋白Mmi1（而非MTREC）与体内的Ccr4-not复合物相关。
(A类)一步亲和纯化后，银染SDS聚丙烯酰胺凝胶显示蛋白质在最小培养基（EMM0.5X）中与TAP标记的Mmi1共洗脱。在免疫沉淀和TEV裂解之前，用RNaseA/T1处理提取物。作为对照，使用表达未标记蛋白质的细胞提取物。指示了诱饵蛋白（Mmi1-CBP）和TEV的位置。(B类)液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析Mmi1-TAP相关蛋白的结果。显示了序列覆盖率、得分（即用Percolator算法提供的后验错误概率-log10表示的已识别肽的显著性）和分子量的百分比。(C类)Western blot显示Not1-3xFLAG与Mmi1-TAP在最小培养基（EMM0.5X）中以RNA和Red1非依赖性的方式共同免疫沉淀。（WCE）全细胞提取物；（IP）免疫沉淀。(D类)Western blot显示Not1-3xFLAG与最小培养基（EMM0.5X）中的Mmi1-TAP共免疫沉淀，但与Mtl1-TAP和Red1-TAP无共免疫沉淀。（WCE）全细胞提取物；（IP）免疫沉淀。
图1——图补充1。
图1补充图1。RNA-结合蛋白Mmi1与体内Ccr4-not复合物相关，但与MTREC无关。
(A类)RT-qPCR分析我的4+,战略物资保障4+和微通道蛋白5+在最小培养基（EMM0.5X）中生长的Mmi1-TAP细胞中的减数分裂转录物。信号标准化为行为1+mRNA水平，并且相对于野生型菌株表达。Rrp6缺失菌株用作对照。误差线表示三个独立实验的标准偏差。注意，Mmi1-TAP细胞显示出减数分裂转录物的少量积累。(B类), (C类)Western blots显示Caf1-3xFLAG(B类)和Mot2-GFP(C类)以不依赖于RNA和Red1的方式在最小培养基（EMM5.5X）中与Mmi1-TAP共免疫沉淀。(D类)Western blot显示Caf1-3xFLAG在富培养基（YE）中与Mmi1-TAP共免疫沉淀，但与Mtl1-TAP和Red1-TAP无共免疫沉淀。
图2。
图2 E3泛素连接酶Mot2是减数分裂mRNA抑制所必需的。
(A类)RT-qPCR分析我的4+,战略物资保障4+和微通道蛋白5+在富培养基（YE）中生长的细胞中的减数分裂转录物，并删除Ccr4、Caf1、Mot2或Rrp6。信号标准化为行为1+与野生型菌株相关的mRNA水平和表达。误差线表示至少三个独立实验的标准偏差。星形表示相对于野生型细胞的统计显著性（t检验p值：我的4+=2.4E-5；战略物资保障4+=7.84E-3；微通道蛋白5+=5.88E-3）。(B类)RT-qPCR分析我的4+,战略物资保障4+和微通道蛋白5+在最小培养基（EMM0.5X）中生长的细胞中的减数分裂转录物，并删除所有非必需的Ccr4-Not亚基（即除Not1外的所有亚基）或Rrp6作为对照。信号标准化为行为1+与野生型菌株相关的mRNA水平和表达。误差线表示至少三个独立实验的标准偏差。星形表示相对于野生型细胞的统计显著性（t检验p值电机2∆和rrp6∆菌株：我的4+=2.28E-3和4.34E-3；战略物资保障4+=1.74E-3和1.34E-3；mcp5型+=2.26E-3和5.83E-3）。(C类)比较电机2∆最小培养基（EMM0.5X）中的（副本）和野生型（三副本）转录组。火山图显示了RNA-seq分析中确定的转录物在x轴上的折叠变化（log2）和y轴上的P值分布（-log10P值）。每个点代表一份抄本，颜色代码表示Mmi1靶点的不同功能类别，如Hiriart等人（2012年）所述。(D类)文氏图显示稳定转录物的重叠电机2∆和rrp6∆菌株，并与Mmi1靶点进行比较（Hiriart等人，2012年）。R包«SuperExactTest»（Wang等人，2016）用于计算交叉点的p值：电机2∆∩rrp6∆=6.98E-24；电机2∆∩mmi1∆=4.4E-25；mmi1∆∩rrp6∆=1.63E-16；电机2∆∩rrp6∆∩mmi1∆=4.85E-40。
图2——图补充1。
图2补充图1。E3泛素连接酶Mot2与减数分裂mRNA结合。
野生型细胞的RNA-免疫沉淀实验。显示的是行为1+,美4+和微通道蛋白5+经3xFLAG标记的Mmi1、Mot2和Caf1下拉后的转录物。误差条表示三个或四个独立免疫沉淀与生物副本的标准偏差。星形表示统计显著性（3xFLAG-tagged Mmi1、Mot2和Caf1菌株的t检验p值：美4+=2.3E-4、3.2E-2和3.7E-2；微通道蛋白5+=1.5E-3、1.7E-2和3.5E-3）。
图3。
图3 E3泛素连接酶Mot2对Mmi1抑制剂Mei2的水平产生负面影响。
(A类)Western blot显示体重和体重中Mei2-3xHA的总水平电机2∆细胞在30°C至中对数期的富（YE）和最小（EMM0.5X）培养基中生长。抗微管蛋白抗体被用作负荷控制。(B类)Western blot显示P41nmt1启动子在wt和电机2∆细胞在最小培养基（EMM0.5X）中生长。抗微管蛋白抗体被用作负荷控制。(C类)TAP-Mei2蛋白水平的量化，归一化为微管蛋白并相对于wt细胞表达。误差线表示五个独立实验的标准偏差。星形表示统计显著性（t检验p值=1.38E-3）。(D类)RT-qPCR分析mei2号机组+,战略物资保障4+和微通道蛋白5+wt和电机2∆从P41nmt1启动子表达Mei2的菌株。细胞在最小培养基（EMM0.5X）中生长。信号标准化为行为1+与P41nmt1-TAP-Mei2菌株相关的mRNA水平和表达。误差线表示四个独立实验的标准偏差。星形表示统计显著性（t检验p值：mei2号机组+=8.5E-3；战略物资保障4+=1.53E-3；mcp5型+=1.49E-3）。
图3——图补充1。
图3图补充1。E3泛素连接酶Mot2对Mmi1抑制剂Mei2的水平产生负面影响。
(A类)RT-qPCR分析mei2号机组+mRNAs在wt和电机2∆细胞在最小培养基（EMM0.5X）中生长。信号标准化为行为1+与野生型菌株相关的mRNA水平和表达。误差线表示至少三个独立实验的标准偏差。星号表示相对于野生型细胞的统计显著性（t检验p值=1.1E-2）。(B类)Western blot显示在野生型细胞和因Ccr4-Not复合物非必需亚基（即除Not1外的所有亚基）而缺失的菌株的最低培养基（EMM0.5X）中P41nmt1启动子表达的总TAP-Mei2水平。抗微管蛋白抗体被用作负荷控制。
图4。
图4 Mot2与Mmi1一起作用以限制Mei2和减数分裂mRNA的积累。
(A类), (B类)RT-qPCR分析所示遗传背景和在最小培养基（EMM0.5X）中生长的细胞中的减数分裂转录物。图中所示为RNAs水平的折叠富集标准化为行为1+转录本和相对于野生型菌株的表达。误差线表示三个独立实验的标准偏差。(A类)四种减数分裂转录本的配对比较电机2∆与mei2∆mot2∆突变体的p值<7.3E-3。(B类)星形表示相对于野生型细胞的统计显著性（t检验p值：我的4+=1.29E-4；战略物资保障4+=1.9E-3；微通道蛋白5+=6.3E-3；中小企业2+=2.04E-2）。(C类)Western blot显示在RNaseA/T1处理后，Mei2-GFP与Mmi1-TAP共同免疫沉淀电机2∆在最小培养基（EMM5.5X）中生长的细胞。(D类), (E类)Western blot显示Mei2总水平（P41nmt1-TAP-Mei2 in(D类)或Mei2-3xHA英寸(E类))在指定遗传背景的细胞中，并在最小培养基（EMM5.5X）中生长。使用抗tubin和抗CDC2抗体作为面板中的负荷控制(D类)和(E类)分别是。
图4——图补充1。
图4-图补充1电机2∆突变体。
(A类)指数增长野生型的相位对比图像，电机2∆,mei2∆和mot2∆mei2∆细胞在最小培养基（EMM0.5X）中培养。(B类)所示基因型的细胞在丰富（YE；左面板）和最小（EMM0.5X；右面板）培养基中生长，光密度（OD600纳米)随着时间的推移进行测量。
图5。
图5 Mot2和Mmi1不抑制mei2+mRNA翻译。
(A类)野生型和电机2∆细胞。显示的是行为1+和mei2号机组+3xFLAG标记的翻译延伸因子Tef3下拉后的mRNA。误差线表示六种独立免疫沉淀与至少三种生物复制的标准偏差。星号表示样本之间的统计显著性（t检验p值：行为1+=6.87E-3；mei2号机组+=4.26E-3）。(B类)量化mei2号机组+mRNA水平标准化为行为1+与野生型标记菌株（Tef3-3xFLAG）相关的转录本和表达。误差线表示六种独立免疫沉淀与至少三种生物复制的标准偏差。(C类)野生型细胞中的RNA免疫沉淀实验。显示的是行为1+,mei2号机组+,美4+和微通道蛋白5+3xFLAG-tagged Mmi1下拉时的抄本。误差线表示四种独立免疫沉淀与三种生物复制的标准偏差。星形表示统计显著性（t检验p值：我的4+=1.87E-4；微通道蛋白5+=1.35E-3）。(D类)Western blot显示，在37°C温度变化1小时后，在最小培养基（EMM0.5X）中生长的具有指定遗传背景的细胞中的总Mei2-3xHA水平。所示为抗-HA免疫印迹的短期和长期暴露。抗微管蛋白抗体被用作负荷控制。
图5——图补充1。
图5——图补充1..Mot2不抑制mei2号机组+mRNA翻译。
(A类)野生型和电机2∆细胞。显示的是行为1+和mei2号机组+3xFLAG-标记的60S核糖体亚单位Rpl1601被拉下后的mRNA。误差线表示六种独立免疫沉淀与至少三种生物复制的标准偏差。星号表示样本之间的统计显著性（t检验p值：行为1+=4.29E-2；mei2号机组+=1.08E-4）。(B类)量化美2+mRNA水平标准化为行为1+与野生型标记菌株（Rpl1601-3xFLAG）相关的转录本和表达。误差条表示来自至少三个生物重复的六个独立免疫沉淀的标准偏差。星号表示样本之间的统计显著性（t检验p值=1.39E-2）。(C类)Western blot显示Rpl1601和Tef3的总水平不受电动机2+. 用抗FLAG抗体检测3xFLAG标记蛋白，并用抗管蛋白抗体作为负荷对照。
图6。
图6 Mot2的E3泛素连接酶活性是在营养生长期间抑制Mei2所必需的。
(A类)Western blot显示从P41nmt1启动子表达的总TAP-Mei2水平在所示遗传背景的细胞中，并在缺乏亮氨酸的最低培养基（EMM-LEU0.5X）中生长。使用抗FLAG抗体检测pREP41载体表达的Mot2变体。使用抗CDC2抗体作为负荷控制。星号表示一个非特异性带。(B类)Mei2-3xHA在体内的wt泛素化，电机2∆和ubr1∆在最小培养基（EMM-LEU0.5X）中表达6His-tagged-ubiquitin的细胞。分别使用抗HA和抗泛素抗体通过免疫印迹分析总Mei2和泛素结合物。使用未标记的野生型菌株作为阴性对照。恒星表示未经修饰的Mei2分子。(C类)Mei2泛素化物种相对于总蛋白水平的定量，以及相对于Mei2-3xHA野生型细胞的表达。误差线表示五个独立实验的标准偏差。星形表示相对于Mei2-3xHA野生型细胞的统计显著性（t检验p值=2.29E-6电机2∆和5.64E-9ubr1∆). (D类)wt减数分裂转录物的RT-qPCR分析，电机2∆和ubr1∆细胞。图中所示为RNAs水平的折叠富集归一化为行为1+转录本和相对于野生型菌株的表达。误差线表示与生物副本平均值的偏差。
图6——图补充1。
图6补充1。Mot2对Mei2泛素化的贡献。
(A类)Mei2-3xHA在wt和电机2∆如图6B所示。样品电机2∆当从两个菌株中使用相同数量的总Mei2时，对突变株进行连续稀释，以估计泛素化Mei2物种的水平。(B类)如图6B所示，Mei2-3xHA的体内泛素化mts2-1型和mts2-1电机2∆细胞在28°C的EMM-LEU0.5X中生长，然后在37°C的温度变化1小时(C类)Mei2泛素化物种相对于总蛋白水平的定量以及相对于地铁2-1细胞。误差线表示三个独立实验的标准偏差。星形表示相对于地铁2-1Mei2-3xHA应变（t检验p值=1.89E-2）。(D类)如图6B所示，3xFLAG-tagged Mei2在体内泛素化，但在表达内源性蛋白质水平的细胞（如Mei2-3xFLAG）或过度表达该蛋白质的细胞（例如P3nmt1-3xFLAG-Mei2）中。分别使用抗FLAG和抗泛素抗体分析总Mei2和泛素化Mei2以及泛素结合物。所示为抗FLAG免疫印迹的短期和长期暴露。(E类)Mei2泛素化物种相对于总蛋白水平的定量，以及相对于Mei2-3xFLAG野生型细胞的表达。误差线表示与生物副本平均值的偏差。
图6——图补充2。
图6——图补充2。Mot2和Ubr1都限制了Mei2的积累。
(A类)代表性Western blot显示Mei2-3xHA总含量（重量），电机2∆和ubr1∆细胞在30°C的最小培养基（EMM0.5X）中生长。使用抗HA抗体检测Mei2，并使用抗CDC2抗体作为负荷对照。(B类)Mei2-3xHA总水平的量化，归一化为CDC2并相对于野生型细胞表达。误差线表示五个独立实验的标准偏差。星形表示相对于Mei2-3xHA野生型细胞的统计显著性（t检验p值=2.66E-3电机2∆和2.25E-4ubr1∆). (C类)Mei2-3xHA的环己酰亚胺追踪实验，电机2∆和ubr1∆细胞。细胞在30°C的最小培养基（EMM0.5X）中生长，并在添加100µg/mL环己酰亚胺后的指定时间点收获。使用抗HA抗体通过免疫印迹检测Mei2，并且使用抗CDC2抗体作为负载对照。(D类)GFP标记Mei2的活细胞显微镜，电机2∆和ubr1∆细胞。细胞在最小培养基（EMM0.5X）中生长，并通过相位对比和GFP滤波器成像。比例尺=5µm。
图7。
图7.模型。
图中显示了Mmi1招募Mot2（可能在Ccr4-Not的背景下）泛素化其自身抑制剂Mei2的调节电路。E3泛素连接酶Ubr1参与Mei2周转的构成途径。Mot2和Ubr1都有助于维持低水平的Mei2，从而保持Mmi1的活性，并维持营养细胞减数分裂mRNA的抑制。
作者回复图片1。
作者回复图片1.动力学35芽殖酵母和裂变酵母对S-蛋氨酸的吸收。
酿酒酵母（BY4742）和S.pombe公司野生型细胞分别在YNB（酵母氮基，2%葡萄糖）和EMMO.5X培养基中生长到指数期（OD=0.3和0.45）。50µCi35S-蛋氨酸（EasyTag L-[35S] -将蛋氨酸、NEG709A005MC、PerkinElmer）添加到5 mL培养物中，并使用0.2µm过滤器在以下时间点收集细胞：30秒、10分钟、20分钟、40分钟和60分钟。使用液体闪烁计数器（WALLAC 1409 DSA、Perkin Elmer35S-蛋氨酸摄取量（填充线）和35培养基中残留的S-蛋氨酸（虚线）。蓝色和红色曲线表示酿酒酵母和S.pombe公司分别是。
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参考文献

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