Oxygen nanobubbles revert hypoxia by methylation programming

doi:10.1038/s41598-017-08988-7

.2017年8月24日；7(1):9268.

doi:10.1038/s41598-017-08988-7。

氧纳米气泡通过甲基化编程逆转缺氧

Pushpak N Bhandari公司^1 2, 易翠^1 2, 贝内特·德·埃尔泽伊^三, 克雷格·J·戈根⁴, 克里斯托弗·M·朗^1 2, 约瑟夫·伊鲁达亚拉吉^5 6

附属公司

¹美国印第安纳州西拉斐特大学南街225号普渡大学癌症研究中心宾利生物科学中心农业与生物工程系，邮编：47907。
²普渡大学癌症研究中心，印第安纳州西拉斐特，47907，美国。
^三美国印第安纳州西拉斐特普渡大学比较病理学系，邮编：47907。
⁴美国印第安纳州西拉斐特普渡大学韦尔登生物医学工程学院，邮编：47907。
⁵美国印第安纳州西拉斐特大学南街225号普渡大学癌症研究中心宾利生物科学中心农业与生物工程系，邮编：47907。josephi@purdue.edu。
⁶普渡大学癌症研究中心，印第安纳州西拉斐特，47907，美国。josephi@purdue.edu。

PMID： 28839175
预防性维修识别码：项目经理5570893
内政部： 10.1038/s41598-017-08988-7

氧纳米气泡通过甲基化编程逆转缺氧

Pushpak N Bhandari公司等。科学代表. 2017.

.2017年8月24日；7(1):9268.

doi:10.1038/s41598-017-08988-7。

作者

Pushpak N Bhandari公司^1 2, 易翠^1 2, 贝内特·德·埃尔泽伊^三, 克雷格·J·戈根⁴, 克里斯托弗·M·朗^1 2, 约瑟夫·伊鲁达亚拉吉^5 6

附属公司

¹美国印第安纳州西拉斐特大学南街225号普渡大学癌症研究中心宾利生物科学中心农业与生物工程系，邮编：47907。
²普渡大学癌症研究中心，印第安纳州西拉斐特，47907，美国。
^三美国印第安纳州西拉斐特普渡大学比较病理学系，邮编：47907。
⁴美国印第安纳州西拉斐特普渡大学韦尔登生物医学工程学院，邮编：47907。
⁵美国印第安纳州西拉斐特大学南街225号普渡大学癌症研究中心宾利生物科学中心农业与生物工程系，邮编：47907。josephi@purdue.edu。
⁶普渡大学癌症研究中心，印第安纳州西拉斐特，47907，美国。josephi@purdue.edu。

PMID： 28839175
预防性维修识别码：项目经理5570893
内政部： 10.1038/s41598-017-08988-7

摘要

靶向缺氧肿瘤微环境在肿瘤表观遗传学和治疗学中具有广泛的影响。氧气包裹的纳米羧甲基纤维素纳米气泡被开发出来，用于缓解肿瘤的缺氧区域，以削弱缺氧驱动途径并抑制肿瘤生长。我们表明，肿瘤缺氧区域的5-甲基胞嘧啶（5mC）低甲基化可以通过表观遗传调控恢复，从而在体内外使用小于100 nm大小的氧纳米气泡来增强癌症治疗。在小鼠模型中，氧纳米气泡在显著延缓肿瘤进展和提高生存率方面是有效的。此外，由于氧纳米泡（ONB）处理，在BRCA1的启动子DNA区域观察到显著的高甲基化。除了用作超声造影剂外，纳米气泡还可以重新编程一些缺氧相关和肿瘤抑制基因，如MAT2A和PDK-1。我们开发纳米氧囊泡作为甲基化逆转超声造影剂的方法有望在表观遗传编程中产生重大影响，并作为癌症治疗的佐剂。

PubMed免责声明

利益冲突声明

P.B.和J.I.宣布在类似纳米材料的未来开发和商业化中存在潜在的财务利益。普渡研究基金会（PRF）技术商业化办公室（OTC）已为该技术申请了非临时专利USSN:14/873208。

数字

图1
氧纳米泡结构和5mC超甲基化机制。(一)氧纳米气泡的示意图；(b条)氧纳米气泡（红色箭头）位于细胞质和细胞核中的HeLa细胞内。提供了显著增强的暗场显微镜图像。比例尺 = 10 微米。

图2
体外纳米气泡的表征、缺氧重编程和成像。(一)纳米气泡的TEM图像，其核心有一个氧气室，被羧甲基纤维素钠外壳包围。比例尺 = 50 纳米。(b条)纳米气泡的动态光散射（DLS）尺寸分布。(**c（c）**)不同浓度纳米气泡（0–300）产生的相应信号的超声图像微克/毫升）。产生这种对比的原因是纳米气泡中的氧气。比例尺 = 1毫米(d日)显示与纳米气泡浓度增加（0–300）相对应的平均灰度强度的图形微克/毫升）。结果是三个独立实验的平均值。误差条表示 ± s.d.注意，平均超声灰度强度与纳米气泡浓度之间存在显著的线性关系（参见补充图1）。

图3
ONB干扰5mC低甲基化*在体外*. (一)使用ELISA对不同处理方法测定的HeLa细胞中5mC甲基化水平，以及0.5 mg/mL纳米气泡浓度，以确定处理频率与总培养时间之间的关系。（+/-）表示添加纳米气泡0的样品培养小时后，24小时后不添加纳米气泡培养时间。（−/+）表示0后没有添加纳米气泡的样品培养小时，但24小时后添加纳米气泡培养时间。（+/+）表示样品在两个0之后添加纳米气泡小时和24小时培养时间。(b条)用ELISA测定HeLa细胞缺氧条件下不同浓度纳米气泡处理的5mC甲基化水平。所有样品的纳米气泡处理体积和处理时间相同。(**c（c）**)使用LC-MS/MS对不同处理方法测量的HeLa细胞中归一化5mC甲基化水平，以及0.5 mg/mL纳米气泡浓度，以确定处理频率与总培养时间之间的关系。（+/-）表示添加纳米气泡0的样品培养小时后，24小时后不添加纳米气泡培养时间。（−/+）表示0后没有添加纳米气泡的样品培养小时，但24小时后添加纳米气泡培养时间。（+/+）表示样品在两个0之后添加纳米气泡小时和24小时培养时间。使用LC-MS/MS分析样品(d日)使用LC-MS/MS在HeLa细胞缺氧条件下对不同浓度的纳米气泡处理测定HeLa电池中的5mC甲基化水平。所有样品的纳米气泡处理体积和处理时间相同。结果是三个独立实验的平均值 ± 未用相同字母连接的平均值有显著差异。通过Tukey多重比较检验的单因素方差分析（ANOVA）确定显著性**P（P）* < 0.05之间。

图4
监测体内缺氧细胞中氧纳米气泡的生物分布和抑瘤能力。(一,b条)超声换能器采集100只NSG小鼠瘤内灌注的典型B超图像 µL纳米气泡(一)和生理盐水(b条). 方框轮廓显示了在注射中心手动定位的感兴趣区域（ROI），用于量化超声信号。比例尺 = 1毫米(**c（c）**)覆盖盐水注射（CTRL）和纳米泡注射（红色条，超过4天）肿瘤的ROI的平均超声灰度。结果是平均值 ± 每组进行三次独立测量。(d日)氧气纳米泡处理的MB49荷瘤小鼠肿瘤体积（1 mg/mL ONB，0.1 µg/kg小鼠体重），阿霉素（40 mg/kg小鼠体重）、生理盐水（对照）或纳米泡壳（1 毫克/毫升，0.1 µg/kg小鼠体重）。在第12天，当肿瘤达到10毫米时，对小鼠进行瘤内注射治疗 ± 2毫米（n = 阿霉素组、对照组和ONB组各10例；n个 = NB壳体组为5）。(**e（电子）**)荷瘤小鼠的存活部分。计算各组的平均生存时间（天）。

图5
代谢（CD31，CAIX）、缺氧（HIF-1α，Hypoxyprobe）和组织形态学标记物的免疫组织化学染色模式。用纳米泡壳（CTRL）或氧纳米泡（治疗）处理的MB49肿瘤组织的显微图像：HIF-1的表达（免疫组织化学，放大×40，比例尺 = 100 µm）在CTRL中(一)和ONB(b条)经治疗的肿瘤在对照肿瘤中显示出强HIF-1表达，而在ONB治疗的肿瘤中显示出弱阳性表达。用于控制的代表性IHC图像(**c（c）**)和ONB(d日)经治疗的肿瘤组织显示，与对照组相比，ONB治疗组的CD31表达水平显著降低(*P（P）* < 0.05). 对照肿瘤切片中Hypoxyprobe-1加合物和组织坏死的缺氧免疫染色代表性图像(**e（电子）**)和ONB处理(**（f）**). 对照肿瘤切片中CAIX染色的代表性图像(克)和ONB处理(小时). 相应肿瘤切片的H&E染色组织学图像显示肿瘤细胞体积显著降低（%细胞体积/mm²ONB治疗的小鼠(j)与注射ONB外壳的肿瘤切片进行比较(我). 以40倍物镜放大率拍摄的图像。比例尺 = 100 微米。免疫组织化学HIF-1蛋白定位分析显示每毫米HIF-1阳性细胞数显著减少²接受ONB治疗的肿瘤区域(k个). CD31血管密度的组织形态计量学定量(我).

图6
定量实时PCR、LC-MS和基因特异性甲基化分析体内肿瘤。(一)LC-MS/MS定量小鼠模型中HeLa（左）和MB49（右）细胞的纳米泡壳（CTRL）和氧气纳米泡（治疗）治疗组中5-甲基-2′-脱氧胞苷（5mdC）与脱氧胞嘧啶（dC）的比值。(b条)通过qRT-PCR测定HIF-1α、PDK-1和MAT2A的转录水平。（n） = 16,p值通过方差分析计算）。(**c（c）**)22个选定肿瘤抑制基因启动子甲基化的变化。(d日)氧纳米泡诱导人类BRCA1启动子区CpG岛DNA甲基化的变化。甲基化程度在体内用纳米气泡或盐水治疗肿瘤。甲基化水平通过亚硫酸氢盐处理DNA后进行焦磷酸测序进行测量，并以17号染色体启动子区的变化%表示****P（P）* < 0.001, ***P（P）* < 0.01, **P（P）* < 0.05之间。

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[8] Lo C-L、Choudhury SR、Irudayaraj J、Zhou FC。神经干细胞中Ascl1基因的表观遗传学编辑。科学报告。2017;7网址：10.1038/srep42047。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

[9] Cui Y，Irudayaraj J.通过单分子光谱学和显微镜分析MBD3在DNA甲基化稳态中的行为和功能。核酸研究。2015;43:3046–3055. doi:10.1093/nar/gkv098。-DOI程序-项目管理咨询公司-公共医学

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