USP26 functions as a negative regulator of cellular reprogramming by stabilising PRC1 complex components

doi:10.1038/s41467-017-00301-4

.2017年8月24日；8(1):349.

doi:10.1038/s41467-017-00301-4。

USP26通过稳定PRC1复合物成分发挥细胞重编程的负调控作用

博宁¹, 魏昭^1 2, 陈倩¹, 刘平华¹, 李青田¹, 李文元^1 三, 王荣福^4 5

附属公司

¹美国德克萨斯州休斯顿市休斯顿卫理公会研究所炎症和表观遗传学中心，邮编77030。
²中山大学教育部干细胞与组织工程重点实验室，广州，510080。
^三中南大学湘雅医学院湘雅医院，长沙，410008，中国。
⁴美国德克萨斯州休斯顿市休斯顿卫理公会研究所炎症和表观遗传学中心，邮编77030。rwang3@houstonmethodist.org。
⁵康奈尔大学威尔康奈尔医学院微生物与免疫学系，美国纽约州纽约市，邮编10065。rwang3@houstonmethodist.org。

PMID： 28839133
预防性维修识别码：项目编号：C5571198
内政部： 10.1038/s41467-017-00301-4

USP26通过稳定PRC1复合物成分发挥细胞重编程的负调控作用

博宁等。国家公社. 2017.

.2017年8月24日；8(1):349.

doi:10.1038/s41467-017-00301-4。

作者

博宁¹, 魏昭^1 2, 陈倩¹, 刘平华¹, 李青田¹, 李文元^1 三, 王荣福^4 5

附属公司

¹美国德克萨斯州休斯顿市休斯顿卫理公会研究所炎症和表观遗传学中心，邮编77030。
²中山大学教育部干细胞与组织工程重点实验室，广州，510080。
^三中南大学湘雅医学院湘雅医院，长沙，410008，中国。
⁴美国德克萨斯州休斯顿市休斯顿卫理公会研究所炎症和表观遗传学中心，邮编77030。rwang3@houstonmethodist.org。
⁵美国纽约州康奈尔大学威尔康奈尔医学院微生物学和免疫学系，邮编10065。rwang3@houstonmethodist.org。

PMID： 28839133
预防性维修识别码：项目编号：C5571198
内政部： 10.1038/s41467-017-00301-4

摘要

尽管在理解体细胞重编程的复杂过程方面取得了很大进展，但有关调控的分子机制的许多问题仍有待回答。目前，人们对重编程过程负调控的认识确实很差，这与识别正调控相反。在这里，我们首次报道了泛素特异性蛋白酶26通过去除K48连接的多泛素化，稳定多梳抑制复合物1的含有染色体（CBX）的蛋白CBX4和CBX6，从而负调控体细胞重新编程过程。因此，累积的CBX4和CBX6通过PRC1复合物在其启动子处泛素化组蛋白H2A来抑制多能性基因的表达，如Sox2和Nanog。总之，我们的发现揭示了泛素特异性蛋白酶26通过多梳抑制复合物在细胞重编程中的重要作用1。泛素-蛋白酶体系统通过降解关键多能性因子来调节细胞重编程。在这里，作者报告了PRC1组分CBX4和CBX6的翻译后调控通过泛素化影响重编程。

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数字

图1
USP26作为多能性负调控因子的鉴定。一筛选基本要素的实验策略示意图美元用于生成iPSC。将Dox-诱导的OSKM-转基因MEF与48只小鼠进行转染*Usp公司*shRNA慢病毒载体敲除美元和AP染色⁺Dox治疗12天后的iPSC菌落。b条AP的量化⁺用shRNA转导的MEF中OSKM诱导12天后的菌落，靶向小鼠成员*Usp公司*家庭，第页 < 0.001与对照shRNA相比。**c（c）**AP的量化⁺小鼠转导的MEFs中OSKM诱导12天后的集落*26美元*shRNA，*20美元*shRNA或控制shRNA慢病毒*第页 < 与对照shRNA相比0.05**第页 < 与对照shRNA相比为0.01。d日AP的量化⁺用pLtet-O（四环素诱导）小鼠转导的MEF中OSKM诱导12天后的菌落*美元26*,*20美元*或空载体慢病毒**第页 < 与EV相比为0.01。电子用对照shRNA转导的MEF在OSKM诱导12天后iPSC集落的AP染色图像，*26美元*shRNA、EV或pLtet-O慢病毒过度表达*26美元*.（f）Oct4、Nanog和Dppa4的亮场（BF）和免疫荧光显微图像*美元26*击倒iPSC。iPSC菌落固定、封闭并用特异性抗体染色，然后用山羊抗鼠抗体结合的德克萨斯红染色。细胞核用DAPI染色。*比例尺*, 100 微米。数据以平均值表示 ± SD来自三个独立实验。b条–d日多重比较的双向方差分析

图2
ESC区分需要USP26。一小鼠实时qPCR分析*26美元*MEF、iPSCs和ESCs中的mRNA表达**第页 < 与MEF相比为0.01。b条MEF、iPSCs和ESCs中USP26蛋白表达的Western blot分析。**c（c）**小鼠实时qPCR分析*26美元*和纳克在第0、4、8和12天Dox诱导的OSKM介导的MEF重编程期间的mRNA表达*第页 < 与相比0.0526美元**第页 < 与第0天相比，0.05。d日小鼠实时qPCR分析*26美元*和纳克LIF停药和1 第1、2、3和4天的μM RA*第页 < 与相比0.0526美元, **第页 < 与第1天相比为0.05。电子免疫印迹分析LIF停药后ESCs中USP26、OCT4和NANOG蛋白的表达第0天、第2天、第4天和第6天的RA为μM。β-actin作为负荷对照。**（f）**Usp26诱导ESC分化的实验方案。用Dox-inducible GFP-tagged Usp26或空载体慢病毒转导ES细胞。ESC菌落形成后，低剂量Dox（0.1 µg/ml）添加1 预选日。第0天定义为预先选择的GFP阳性菌落在iSF1培养基中与高剂量Dox（2 µg/ml），在表达第1、2、3和4天的Usp26上追踪单个菌落并拍照。克Dox-诱导GFP-标记m的ESC形态亮场（BF）和荧光显微图像*26美元*过表达或使用GFP标记的空载体（EV）。小时野生型（WT）或*26美元*敲除（KO）ESCs用RA治疗。WT或*26美元*KO ESCs在ES分化培养基中培养（LIF退出，1 μM RA）。在第0天、第2天、第4天和第6天在显微镜下对单个菌落进行跟踪和拍照。数据以平均值表示 ± SD来自三个独立实验。一,**c（c）**,d日多重比较的双向方差分析

图3
USP26抑制多能性和多梳基因表达。一小鼠实时PCR（qPCR）分析*Sox2系统*,纳克,*10月4日*、和*抄送x7*mRNA表达*美元26*或控制shRNA慢病毒转导的OSKM MEF(*第页 < 与对照shRNA相比为0.05）。b条,**c（c）**小鼠实时PCR（qPCR）分析*Sox2系统*,纳克,*10月4日*、和*抄送x7*OSKM MEF中mRNA的表达b条和ESCc（c）用小鼠转染*美元26*或空矢量（EV*第页 < 与EV相比为0.05**第页 < 与EV相比为0.01）。数据以平均值表示 ± SD来自三个独立实验。一–**c（c）**多重比较的双向方差分析

图4
USP26与PRC1成分相互作用。一用HA标记的RING1A、RING1B、RYBP、PCGF1、PCGF2、BMI1、CBX4、CBX6、CBX7或CBX2加FLAG-hUSP26或空载体转染293T细胞。在用抗FLAG珠进行IP后，使用抗HA抗体通过western blotting分析特定蛋白。b条用或不用小鼠USP26慢病毒感染小鼠ESC，在不同时间点采集细胞提取物，用抗USP26抗体免疫沉淀，并用特异性抗体进行western blotting分析，如图所示。**c（c）**用FLAG-USP26转染RING1A、CBX4和CBX6敲除（KO）293T细胞，收集细胞提取物，用抗FLAG抗体免疫沉淀，并用特异性抗体进行免疫印迹分析，如图所示

图5
USP26通过去除K48连接的多泛素化来稳定CBX4和CBX6蛋白质。一,b条用小鼠转导MEF26美元或EV慢病毒，采集细胞提取物，用qPCR分析mRNA水平一用特异性抗体进行蛋白质印迹分析b条，如图所示。**c（c）**小鼠胚胎干细胞感染Dox-inducible m26美元在第0天、第2天、第4天和第6天采集慢病毒和细胞裂解物，并使用所示抗体进行western印迹分析。d日USP26脱泛素酶活性测定。纯化的USP26与K48连接或K29连接的泛素化链孵育3 h.用抗Ub抗体免疫印迹法检测分离的Ub。电子293T细胞转染带有或不带有Myc-tagged WT或Myc-tag突变体（C304S或Δ295-312）USP26的HA标记的K48连锁Ub、FLAG-CBX4或FLAG-CBX6。在用抗FLAG珠进行IP之后，使用抗HA抗体通过蛋白质印迹分析CBX4或CBX6的泛素化。数据以平均值表示 ± SD来自三个独立实验。一未配对双尾学生t吨-测试

图6
CBX4和CBX6蛋白与多能性基因启动子结合并抑制其表达。一ChIP–PCR分析*Sox2系统*,纳克,*10月4日*、和*抄送x7*m转导的ESCs中的启动子*26美元*, *第页 < 与第0天相比为0.5。b条ChIP–PCR分析*Cbx4型*和*抄送x6*转导m的ESCs中的启动子*26美元*, *第页 < 0.5, **第页 < 与第0天相比为0.01。**c（c）**萤光素酶测定*10月4日*,*Sox2系统*,纳克、和*抄送x7*EV的发起人，*Cbx4型*,*抄送x6*，或*Cbx4型*、和*抄送x6*联合转染*第页 < 与EV相比为0.5。红箭指示ChIP–PCR目标和*黑色箭头*指示特定基因启动子的转录起始位点（TSS）。数据以平均值表示 ± SD来自三个独立实验。一,b条未配对双尾学生t吨-测试。**c（c）**多重比较的双向方差分析

图7
拆除CBX4和CBX6可促进MEF重新编程。一感染OSKM的MEF细胞诱导iPSC集落AP染色*Cbx4型*,*抄送x6*,*Cbx7型*,*环1a*或控制shRNA慢病毒**第页 < 与对照shRNA相比为0.01。b条 *Sox2系统*,纳克、和*10月4日*MEF重编程期间mRNA表达水平*Cbx4型*,*抄送x6*,*抄送x7*,*环1a*或对照shRNA慢病毒**第页 < 与对照shRNA相比为0.01。**c（c）**USP26在ESC分化和MEF重编程中的拟议作用。USP26去除CBX4和CBX6中的Ub以稳定。累积的CBX4和CBX6与多能性基因的启动子结合，例如*Sox2系统*,纳克和Polycomb基因，例如*抄送x7*数据以平均值表示 ± 来自四个独立实验的SD。一,b条多重比较的双向方差分析

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1. Takahashi K等。通过确定的因子从成人成纤维细胞诱导多能干细胞。单元格。2007;131:861–872. doi:10.1016/j.cell.2007.11.019。-内政部-公共医学
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[7] Vierbuchen T，Wernig M.细胞重编程的分子障碍。分子细胞。2012;47:827–838. doi:10.1016/j.molcel.2012.09.008。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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