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.2017年8月14:6:e28202。
doi:10.7554/eLife.28202。

有效靶向内核膜的蛋白质需要Atlasting依赖性维持内质网拓扑结构

附属公司

有效靶向内核膜的蛋白质需要Atlasting依赖性维持内质网拓扑结构

苏米特·帕瓦尔等。 埃利夫. .

摘要

新合成的膜蛋白通过在内质网(ER)膜系统内扩散、通过核孔复合体(NPC)转位和在核伴侣上滞留,靶向内核膜(INM)。我们之前通过可视化体外实验证明,靶向INM的有效蛋白质依赖于核苷酸水解。我们现在发现INM靶向依赖于GTP。利用INM靶向性的体外重建和体内分析,我们确定Atlastis,即内质网膜结合GTPases,通过保持内质网拓扑结构的持续活性,维持蛋白质对INM的有效靶向性。当内质网拓扑结构改变时,内质网中蛋白质的远距离扩散交换和对INM的靶向效率降低。我们强调了正确的内质网拓扑的一般重要性,表明Atlastis也影响鼻咽癌的生物发生和分泌物质从内质网中及时排出。

关键词:呃;GTP酶;阿特拉斯锡;生物化学;细胞生物学;人;内核膜;膜蛋白;核膜。

PubMed免责声明

利益冲突声明

没有宣布竞争利益。

数字

图1。
图1.体外膜蛋白靶向INM依赖于GTP水解。
(A类)INM蛋白质体外转运试验示意图(Ungricht等人,2015)。(B类)在半透性HeLa细胞中重建LBR(1-245)-GFP和SUN2-GFP的靶向性。INM靶向反应是在HeLa细胞提取物存在的情况下进行的,该提取物通过apyrase处理耗尽NTP或补充能量再生系统,以及0.3 mM GTPγS或ATPγS,如图所示。在37°C下培养细胞45分钟后,通过共焦显微镜对细胞进行固定和成像。NE富集被量化为NE处的综合荧光强度与总荧光强度(ER和NE)的比值,相对于TEV释放前NE处分数进行归一化。平均值±标准差;n≥63***p<0.0001。(C类)重组LBR(1-245)-GFP靶向45分钟,加入补充有apyrase的缓冲液,在缺少或存在0.3 mM GTPγS的情况下加入能量再生系统的缓冲液或补充有0.75 mM GTP-或ATP的缓冲液。平均值±SD;n≥139***p<0.0001。比例尺:10μm。
图2。
图2:在GTPγS的存在下,ER蛋白的流动性降低。
(A类)用高度互联的多边形内质网(左)或更稀疏连接的多边形和小管网络(右)说明细胞内质网组织的假设差异的模型。在指示圆圈内标记蛋白的荧光漂白后,由于ER组织的差异,荧光蛋白从周围的ER网络扩散到漂白区域的动力学可能不同。(B类)在HeLa细胞裂解物和能量存在下,半渗透细胞内质网中2xRFP-tev-LBR(1-245)-GFP的FRAP,并进一步补充缓冲液0.3 mM ATPγS或GTPγS。从FRAP实验得出的回收曲线和流动分数。平均值±标准差(左曲线);平均值±SD(条形图);N≥2;n≥16**p<0.01。(C类)用半渗透细胞对ER中Sec61β-GFP进行FRAP,如(B类). 从FRAP实验得出的回收曲线和流动分数。平均值±SD(左曲线);平均值±SEM(条形图);N≥4;n≥32****p<0.0001。(D类)在存在HeLa细胞裂解物和能量的情况下,在不存在和存在0.3 mM GTPγS的情况下对表达GFP-KDEL的半渗透细胞进行FLIP。平均值±SD;N=3;n≥9。比例尺,10μm。
图3。
图3 GTP水解的抑制影响内质网形态。
(A类)B.实验装置示意图(B类)表达2xRFP-tev-LBR(1-245)-GFP的报告细胞被半渗透,并允许在HeLa细胞裂解液中恢复,并在37℃下恢复能量。30分钟后,将非水解ATP或GTP类似物添加到0.3 mM的最终浓度。从恢复阶段开始,每5分钟执行一次FRAP,并在添加核苷酸类似物后继续执行。随时间变化的可移动分数。平均值±SEM,N≥3;n≥20。(C类)微量注射GTP或GTPγS后表达GFP-KDEL的U2OS细胞外周ER网络的形态。Alexa Fluor 647标记的右旋糖酐用作注射标记物。缩放面板的比例尺为10μm、2μm。(D类)E和F中实验的示意图(E类)用含有10 mM GTP或GTPγS和荧光右旋糖酐的溶液微量注射表达EGFP-KDEL的U2OS细胞。注射后5至15分钟,在1分钟(1帧/s)的时间过程中对细胞进行成像,以可视化外周ER网络中的膜动力学。显微注射后早期(约5分钟后)成像的细胞显示长的未连接小管,后期(约15分钟后)图像显示外周内质网碎裂。标尺,2μm。(F类)电影中的ER动力学(E类)通过对100μm内成功(如顶部面板)或失败的膜小管连接(如底部面板)的数量进行评分进行量化2注射GTP或GTPγS的细胞面积(视频1和2)。平均值±SEM;N≥3;n≥13;两个100μm2每个单元格的正方形***p<0.0005。比例尺,2μm。
图4。
图4:Atlastin 2缺失损害了体外INM靶向性。
(A类)如图所示,2xRFP-tev-LBR(1-245)-GFP表达报告细胞和ATL3敲除(KO)报告细胞的代表性图像被RNAi耗尽ATL2。从细胞底部到细胞核赤道以0.37μm步长拍摄的6幅图像的最大强度投影。比例尺:10μm(上面板);2μm(下面板)。(B类)Western blot证实ATL2的耗竭和ATL3的敲除。(C类)TEV裂解和添加HeLa细胞裂解物和能量后45分钟,对照组或Atlasting完全半渗透细胞NE中LBR(1-245)-GFP的累积。平均值±SEM;N=4;n≥239****p<0.0001。比例尺,10μm。(D类)表达2xRFP-tev-LBR(1-245)-GFP报告子的半渗透亲本或ATL3 KO细胞ER中的FRAP。用所示的对照或ATL2 siRNAs处理细胞,并在半渗透后补充HeLa细胞裂解液和能量。平均值±SD(左图)。从FRAP实验得出的流动分数和表观扩散系数;平均值±SEM;N=3;n≥21**p<0.005。
图4——图补充1。
图4补充图1。LBR和SUN2对INM的靶向依赖于ATL2。
(A类)在TEV切割和在HeLa细胞裂解物和能量中孵育后的指定时间点,通过siRNA在对照细胞和缺乏ATL2、ATL3或共同缺乏ATL2和ATL3的细胞中靶向LBR(1-245)-GFP和SUN2-GFP的INM。平均值±SD;n≥84。比例尺:10μm。(B类)Western blot证实了在A(C类)用六种不同的siRNA去除ATL3后,在体外将LBR(1-245)-GFP靶向NE。(D类)通过Western blotting(左)和qRT-PCR(右)证实C实验中siRNA-介导的ATL3敲除。
图4——图补充2。
图4补充图2。HeLa细胞中ATL3的CRISPR/Cas9敲除验证。
ATL3的基因组序列-/-本研究中使用的等基因克隆。Sanger测序色谱图显示CRISPR靶向的ATL3基因发生indel突变。顶部序列(黑色)表示靶区的野生型序列以及原间隔区、原间隔区邻接基序(PAM)和预期裂解位点(红色箭头)的位置。测序克隆的色谱图中的重叠峰表明ATL3基因的两个拷贝中存在两个不同的indel突变。人工分解色谱图证实了两个等位基因中的帧移位诱导吲哚。
图4——补充图3。
图4补充了图3。Atlastin缺失实验中LBR衍生报告蛋白的NE积累反映了INM靶向性。
用洋地黄素半渗透表达2xRFP-tev-LBR(1-245)-GFP的细胞。在TEV蛋白酶处理后,允许体外INM靶向反应进行45分钟。然后,直接对半渗透细胞进行免疫染色(洋地黄素)或用Triton X-100进行完全渗透。使用针对LBR N末端结构域和Lamin A/C的抗体进行免疫染色,作为NE通透性的对照。在对照细胞中,LBR染色仅在NE用Triton X-100通透性时观察到,而在地高辛处理的细胞中未观察到,表明报告者的INM定位。Triton X-100对去甲肾上腺素(NE)的渗透性表明,报告者中有一部分达到了INM,这可以通过其抗体的可及性来证明。比例尺,10µm。
图5。
图5:显性-阴性阿特拉斯汀(cytATL)导致内质网结构、动力学和INM靶向方面的缺陷。
(A类)U2OS细胞中ER的典型图像,GFP-KDEL和RFP、cytATL2-RFP或cytATL2(R244Q)-RFP过度表达。100μm内的多边形数2面积被量化,作为内质网连通性的度量。平均值±SEM;N≥3;n≥13;一到两个100μm2每个单元格的平方。比例尺:10μm(上面板);2μm(放大的下面板)。(B类)通过活细胞成像分析过表达RFP、cytATL2-RFP或cytATR2(R244Q)-RFP的U2OS细胞的ER动力学(视频3、4和5)。成功或失败的膜小管连接数量如图3F所示。平均值±扫描电镜;N=4;n≥16;两个100μm2每个单元格的正方形**p=0.005。(C类)在存在显性阴性Atlastins的情况下,在体外将LBR(1-245)-GFP靶向NE。表达2xRFP-tev-LBR(1-245)-GFP的报告细胞被半渗透。然后,将半透性细胞与缓冲液或5μM cytATL2、cytATL2(R244Q)、cytATAL3、cytTAL3(R213Q)在37°C的缓冲液中预培养20分钟。在报告蛋白的TEV裂解后,添加添加缓冲液或5μM cytATL2、cytATR2(R244Q)、cytATAL3或cytATL3(R213Q)的能量和HeLa细胞裂解液。使反应进行45分钟,固定样品,并通过共聚焦显微镜分析NE靶向。平均值±SEM;N≥3;n≥294***p<0.0005。比例尺,10μm。
图5——图补充1。
图5-图补充1。添加RabGDI不会损害体外INM靶向性。
(A类)HeLa细胞转染Rab7-GFP或Rab11-GFP(Ari Helenius的礼物)。24小时后,将细胞半渗透,并在37°C下与指定浓度的重组纯化RabGDI孵育20分钟。经过清洗步骤,细胞被固定并通过共焦显微镜进行分析。典型图像显示了与20μM RabGDI孵育后,Rabs从内质网膜中有效释放。(B类)如图所示,半透性2xRFP-tev-LBR(1-245)-GFP表达报告细胞经模拟处理或在37°C下与20μM RabGDI和/或5μM cytATL2预培养20分钟。然后,记者被TEV蛋白酶切割。允许在HeLa细胞裂解液和能量存在下,在20μM RabGDI和/或5μM cytATL2存在下,进行INM靶向反应45分钟。平均值±SEM;N=3;n≥169*p<0。05; **p<0.005。比例尺,10μm。
图6。
图6 Atlastin功能丧失导致膜蛋白靶向INM的动力学延迟。
(A类)使用选择性挂钩(RUSH)系统的保留动画表示(Boncompain等人,2012),在此改编用于活细胞中INM靶向分析。(B类)通过添加250μM生物素将报告者从钩子中释放出来后,每隔5分钟通过共聚焦活细胞显微镜对稳定表达STIM1-NN-Strep的HeLa细胞和LBR(1-245)-SBP-GFP或LAP2β-SBP-GPP INM靶向报告者进行成像。使用ImageJ测量NE处报告子随时间的积累。平均值±SEM;N=3;n>76。比例尺,10μm。(C类)用cytATL2-RFP、cytATL2(R244Q)-RFP或RFP单独转染INM-RUSH报告细胞。24小时后,用生物素释放以INM为目的的报告者,然后用延时显微镜观察其在NE的积累,并按B.Mean±SD进行量化;N≥2;n≥24。(D类)使用mAB414和POM121抗体对Atlastins耗尽的细胞进行免疫荧光染色。请注意,ATL2和ATL3的共同耗竭导致NPC生物发生缺陷,表现为NE染色减少和细胞质结构中核穿孔蛋白的积累。
图6——图补充1。
图6补充图1。INM-RUSH报告员在生物素介导从内质网释放后到达INM。
表达STIM1-NN-Strep和LBR(1-245)-SBP-GFP或LAP2β-SBP-GPP的细胞与生物素孵育90分钟或过夜,然后用洋地黄素半渗透。为了区分细胞质或核内部的抗体表位,细胞要么直接进行免疫染色,要么用0.2%Triton X-100完全渗透。检测中使用的抗体是针对LBR或LAP2β的N末端的,如果蛋白质到达INM,这些抗体将朝向核内部,因此在洋地黄素渗透细胞中无法检测到。与Lamin A/C或Lamin B1共训练可控制NE渗透。比例尺,10µm。
图6——图补充2。
图6补充图2。Atlastin耗竭后INM蛋白的定位。
(A类)在大多数非同步化间期细胞中,NE的稳态INM蛋白水平不受Atlastin耗竭的影响。用emerin、LAP2β、LBR和SUN1抗体对对照细胞和ATL2、ATL3或ATL2和3均缺失的细胞进行免疫荧光染色。比例尺,10μm。(B类)HeLa细胞中ATL2和ATL3共同缺失后,在G1早期INM蛋白的NE靶向无效。细胞与胸腺嘧啶核苷同步并通过有丝分裂进行释放。释放后12小时,固定细胞,并使用针对emerin、LBR、LAP2β和SUN1的抗体进行免疫荧光分析。注意LBR和LAP2β。比例尺,10μ..
图7。
图7.Atlastin耗竭影响分泌运输。
(A类)RUSH系统的卡通表现,允许膜蛋白从活细胞内质网同步分泌运输(Boncompain等人,2012年)。(B类)在加入250μM生物素后,将报告者从钩子中释放出来后,每隔1分钟通过活细胞显微镜对表达Strep-Ii作为钩子和VSVG-SBP-GFP报告者的HeLa细胞进行成像。使用ImageJ(上图)测量了报告者在高尔基复合体中随时间在对照细胞或Atlasting-depleted细胞中的富集度。平均值±SEM;N=3,N≥21。方框图表示观察到的时间点的范围,在该时间点上,报告者得到了丰富的亮点(下图)。N=3,N≥21,****p<0.0001。比例尺,10µm。
图7——图补充1。
图7补充图1。在Atlasting缺失细胞中生物素介导的内质网释放后,VSVG(wt)-SBP-GFP报告蛋白被转运至高尔基复合体。
以Strep-Ii为钩和VSVG(wt)-SBP-GFP为报告基因转染的HeLa细胞未经处理或在250μM生物素存在下培养15分钟,然后用4%PFA固定。为了对高尔基复合体进行染色,用0.2%的Triton X-100渗透细胞,并用针对giantin的抗体进行免疫染色。比例尺,10µm。

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