Endoglin Is Essential for the Maintenance of Self-Renewal and Chemoresistance in Renal Cancer Stem Cells

doi:10.1016/j.stemcr.2017.07.009

.2017年8月8日；9(2):464-477.

doi:10.1016/j.stemcr.2017.07.009。

内皮素对肾癌干细胞自我更新和化疗耐受的维持至关重要

胡俊晖¹, 魏冠², 刘培军², 金代^三, 坤汤², 肖海兵（Haibing Xiao）², 袁倩⁴, 艾莉森·夏罗⁵, 张群叶², 吴莉莉⁶, 华旭⁷

附属公司

¹华中科技大学同济医学院同济医院泌尿科和泌尿研究所，武汉430030；华中科技大学同济医学院同济医院小儿外科，武汉430030；美国加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院分子和医学药理学系，加利福尼亚州洛杉矶市，邮编90095。
²华中科技大学同济医学院同济医院泌尿科和泌尿研究所，中国武汉430030。
^三扬子大学第一附属医院泌尿科，荆州434000。
⁴华中科技大学生物医学工程系生物医学光子学教育部重点实验室，武汉430074。
⁵美国加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院分子和医学药理学系，加利福尼亚州洛杉矶市，邮编90095。
⁶美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子和医学药理学系，加利福尼亚州洛杉矶市，邮编：90095；加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院泌尿系，加利福尼亚州洛杉矶市，邮编90095，美国。电子地址：lwu@mednet.ucla.edu。
⁷华中科技大学同济医学院同济医院泌尿科和泌尿研究所，中国武汉430030。电子地址：xuhua@mail.hust.edu.cn。

PMID： 28793246
预防性维修识别码： PMC5550272型
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2017.07.09

内皮素对肾癌干细胞自我更新和化疗耐受的维持至关重要

胡俊晖等。干细胞报告. 2017.

.2017年8月8日；9(2):464-477.

doi:10.1016/j.stemcr.2017.07.009。

作者

胡俊晖¹, 魏冠², 刘培军², 金代^三, 坤堂², 肖海兵（Haibing Xiao）², 袁倩⁴, 艾莉森·夏罗⁵, 张群叶², 吴莉莉⁶, 华旭⁷

附属公司

¹华中科技大学同济医学院同济医院泌尿科和泌尿研究所，武汉430030；华中科技大学同济医学院同济医院小儿外科，武汉430030；美国加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院分子和医学药理学系，加利福尼亚州洛杉矶市，邮编90095。
²华中科技大学同济医学院同济医院泌尿科和泌尿研究所，中国武汉430030。
^三扬子大学第一附属医院泌尿科，荆州434000。
⁴华中科技大学生物医学工程系生物医学光子学教育部重点实验室，武汉430074。
⁵美国加州大学洛杉矶分校戴维·格芬医学院分子和医学药理学系，加利福尼亚州洛杉矶市，邮编90095。
⁶美国加州大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院分子和医学药理学系，加利福尼亚州洛杉矶市，邮编：90095；加利福尼亚大学洛杉矶分校大卫·格芬医学院泌尿系，加利福尼亚州洛杉矶市，邮编90095，美国。电子地址：lwu@mednet.ucla.edu。
⁷华中科技大学同济医学院同济医院泌尿科和泌尿研究所，中国武汉430030。电子地址：xuhua@mail.hust.edu.cn。

PMID： 28793246
预防性维修识别码： PMC5550272型
内政部： 2016年10月10日/j.stemcr.2017.07.09

摘要

肾细胞癌（RCC）是一种致命的恶性肿瘤，由于其具有转移倾向和化疗耐药。干细胞样肿瘤细胞通常具有这些侵袭性行为。我们在人肾细胞癌异种移植物和患者样本中发现了一种表达endoglin（CD105）的亚群，与亲代细胞相比，该亚群在体外形成球体和在低稀释度下在小鼠中形成肿瘤的能力更强。短发夹RNA和CRISPR/cas9对CD105的敲除降低了茎干标记物和球体形成能力，同时加速了体外衰老。重要的是，下调CD105显著降低了致瘤性和吉西他滨耐药性。这种干样特性的丧失可以通过CDA、MYC或NANOG来挽救，CDA可能充当维持MYC和NANOG的脱甲基酶。在这项研究中，我们发现内皮素（CD105）的表达不仅界定了肿瘤干细胞亚群，而且赋予了自我更新能力，并有助于RCC的化疗耐药性。

关键词：癌症干细胞；胞苷脱氨酶；去甲基化；内皮素；肾癌。

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数字

图1
异种移植肿瘤衍生CD105⁺亚群显示具有分化潜能的干细胞样特征（A）不同人类肾癌细胞系（786-O、ACHN、OS-RC-2、CAKI-1和SN12-PM6）的相对CD105表达谱显示在western blotting（A1）和流式细胞术（其中阳性对照为人类组织细胞淋巴瘤细胞系U-937）（A2）中。（B）细胞分选后，ACHN-CD105⁺流式细胞术（B1）和免疫荧光染色（B2）均显示CD105在细胞中显著高表达（100%）。用（C–F）qRT-PCR（C）、western blotting（D）和免疫荧光染色（E）评估分类ACHN-CD105中茎相关基因的表达⁺细胞及其亲本细胞系。此外，当我们培养分类CD105时⁺细胞在富含营养的分化培养基RPMI-1640+10%FBS中培养2周，用免疫荧光（E）和qRT-PCR（F）分析上皮标记物CK7、间充质标记物VIMENTIN、，和干细胞标记物，如NESTIN和OCT-4（每个分析都进行了三个独立实验。所有误差条均表示平均值±SD。^∗p<0.05；^∗∗p<0.01）。

图2
异种移植肿瘤衍生CD105⁺细胞周期分析显示，CD105的比例要高得多⁺牢房在G区被捕₀阶段（13.48%±2.74%），而亲代（2.84%±0.59%）。（B–F）比色细胞计数CCK8测定法（B）、EdU测定法（C）和集落形成测定法（D）显示CD105⁺细胞增殖比亲代细胞慢。然而，克隆形成试验（D）、β-半乳糖苷酶试验（E）和球状形成试验（F）证明CD105⁺与亲代细胞相比，亚群具有更强的自我更新能力。每个分析都进行了三个独立的实验。所有误差条均表示平均值±SD。^∗p<0.05；^∗∗p<0.01。

图3
CD105⁺肾癌亚群对顺铂和吉西他滨耐药，耐药分子谱（A和B）升高，使用两种经典的癌症化疗药物：顺铂（A）和吉西他滨（B）进行耐药分析。（C）通过qRT-PCR进行化疗相关基因图谱分析。每个分析都进行了三个独立的实验。所有误差条均表示平均值±SD。^∗∗p<0.01。

图4
CD105⁺肾癌亚群比CD105更易致癌⁻亲代细胞*在体内*（A和B）体内原位异种移植物模型显示CD105分类⁺无论从大体上看（A，箭头表示肾脏有肿瘤），还是从体内GFP成像（B，箭头所指的圆圈表示肾肿瘤发生的位置）。（C）（A）和（B）中两组之间的肿瘤重量和肿瘤发生率。（D） NOD/SCID小鼠典型原位肾癌的代表图，人特异性MHC-I抗体免疫组化染色区分肿瘤组织和正常组织。每组用15只小鼠，每组用5只小鼠进行细胞稀释，但每组细胞稀释中只有3只具有代表性。这两组共有30只小鼠。所有误差条均表示平均值±SD。^∗p＜0.05。

图5
CD105中CD105的拆卸⁺肾癌亚群大幅度降低肿瘤干细胞基因表达及成球能力*CDA公司*,*MYC公司*、和*NANOG公司*（A） ACHN-CD105中CD105的敲除⁺细胞系经qRT-PCR（A1）和western blotting（A2）验证。伴随CD105下调，发现一系列与干细胞相关的基因下调（A3），包括NANOG、C-MYC和CDA（见图7B）。（B–F）同时，在ACHN-CD105中敲除CD105后，球状形成能力也降低⁺电池（B1和B2）。在独立过表达NANOG、C-MYC和CDA后，球体形成能力得到挽救（C1和C2），并通过qRT-PCR（D–F）检测可能的下游基因表达谱。每个分析都进行了三个独立的实验。^∗p<0.05；^∗∗p<0.01。

图6
CD105中CD105的拆卸⁺细胞削弱致瘤能力*在体内*在ACHN-CD105中敲除CD105后加速肿瘤细胞衰老（A）⁺细胞，体内原位异种移植实验表明ACHN-CD105的致瘤性⁺CD105后细胞明显减少⁺严重击倒（A1）和使用体内EGFP成像（A2）。各组肿瘤发生率及肿瘤重量如（A3）所示。（B） β-半乳糖苷酶测定的细胞衰老，显示CD105敲除细胞的衰老加剧。在动物研究中，每组使用15只小鼠，每组使用5只小鼠进行细胞稀释，但每组每个细胞稀释中只有3只小鼠具有代表性。这两组共有30只小鼠。进行了三项独立的细胞衰老试验。^∗p<0.05；^∗∗p<0.01。

图7
CD105中CD105的拆卸⁺细胞消除吉西他滨耐药，这种效应可以通过随后在ACHN-CD105中过度表达CDA、MYC或NANOG（A和B）敲低CD105而逆转⁺使细胞系对吉西他滨（A）重新敏感，并减少包括CDA、ABCB1和AICDA（B）在内的化疗耐药基因的表达。（C–E）此外，CDA（C）、C-MYC（D）或NANOG（E）的过度表达克服了CD105敲除诱导的吉西他滨再敏感性。我们还通过腹腔注射吉西他滨或对照药物治疗Balb/c-nu裸鼠皮下异种移植模型（ACHN细胞）。（F）通过流式细胞术分析肿瘤样本的CD105表达，显示CD105的百分比较高⁺吉西他滨治疗的肿瘤细胞与对照组相比。每个分析都进行了三个独立的实验。^∗∗p<0.01。

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[3] Azzi S.、Bruno S.、Giron-Michel J.、Clay D.、Devocelle A.、Croce M.、Ferrini S.，Chouaib S.、Vazquez A.、Charpentier B.分化治疗：用白细胞介素15靶向人肾癌干细胞。J.国家。2011年癌症研究所；103:1884–1898.-公共医学

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[9] Borovski T.、De Sousa E.M.F.、Vermeulen L.、Medema J.P.《癌症研究》2011年；71:634–639.-公共医学

[10] Borovski T.、De Sousa E.M.F.、Vermeulen L.、Medema J.P.《癌症研究》2011年；71:634–639.-公共医学

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