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.2017年11月；1863(11):2973-2986.
doi:10.1016/j.bbadis.2017.07.031。 Epub 2017年7月30日。

TOMM40与晚发性阿尔茨海默病遗传关联的生物学基础

卡利·泽特洛 1, 莱夫科·查兰博斯 2, 艾萨克·吴 三, Sonal Gagrani公司 三, 米尔塔·米霍维洛维奇 4, 骆树红 5, 丹尼尔·L·洛克 5, 安·桑德斯 6, 艾伦D玫瑰 7, W Kirby Gottschalk公司 8
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TOMM40与晚发性阿尔茨海默病遗传关联的生物学基础

卡利·泽特洛等。 Biochim Biophys分子基础疾病学报. 2017年11月.

勘误表in

摘要

TOMM40基因内含子6中的可变长度多-T变异体rs10524523与散发性（晚发性）阿尔茨海默病的风险和发病年龄相关。在白种人中，该位点的三个主要等位基因是Short（S）、Long（L）或Very Long（VL）。在APOEε3/3背景下，S/VL和VL/VL基因型比S/S更具保护性。’523 poly-T具有调节特性，因为在荧光素酶表达系统中，VL poly-T的表达高于S poly-T。当前工作的目的是确定TOM40蛋白表达增加对细胞生物能量学的影响。MitoTracker绿色荧光和自噬小泡染色在对照细胞和过表达细胞中是相同的，但TOM40过表达与TOM20表达增加有关，TOM20是TOM复合物的前蛋白受体，线粒体伴侣蛋白HSPA9和PDHE1a，氧化磷酸化复合物I和IV以及TCA成员α-酮戊二酸脱氢酶的活性增加。与复合物I的发现一致，与TOM40过表达细胞相比，对照细胞中的呼吸对鱼藤酮的抑制更为敏感。在没有抑制剂的情况下，过表达细胞中的总细胞ATP、线粒体膜电位和呼吸升高。TOM40过表达细胞的剩余呼吸容量大于对照组。TOM40过表达阻断了对照细胞线粒体膜电位、细胞ATP水平和细胞活力的异常降低。这些数据表明，TOM40的表达升高可能对线粒体功能具有保护作用。

关键词：阿尔茨海默病；能量学；线粒体；神经变性；汤姆；托姆40。

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数字

图1
图1。大脑TOM40水平与托姆40'523基因型
S/L和VL/L脑样本中TOM40水平呈上升趋势，但S/S和VL/VL样本中没有差异。按照材料和方法中的描述，对脑组织进行均质、分级和探测Tom40。
图2
图2。用完整表达载体转染HeLa细胞（TOM40细胞）与用缺乏表达序列的载体转染细胞（HeLaC细胞）中TOM40的相对水平
TOM40通过蛋白质印迹法测定，如材料和方法中所述。细胞在T-75烧瓶中生长到70-80%的汇合处，并使用细胞刮板将其从平板上机械移除。将细胞悬浮在Hepes-buffered Earl的平衡盐水溶液中，并以500xg离心4分钟收集。丢弃上清液后，将细胞颗粒冷冻并储存在液氮上直至使用。按照材料和方法中的描述提取细胞并进行SDS-PAGE和Western印迹。标准TGX无染色凝胶加载6μL/lane系列1:1稀释的细胞提取物。数据表示每孔12、6和2μg蛋白质负荷的平均值（n=3），并根据材料和方法中所述的总蛋白负荷进行校正。用于估算丰度的标准是非转染HeLa细胞的总细胞提取物。将标准细胞系和所有实验细胞系用相同批次的培养基和血清培养，并在70-80%的汇合处收获。在同一天使用相同的缓冲液提取细胞颗粒，并在相同的凝胶上进行分析。在同一次解冻和四次解冻的细胞中，我们获得了至少三个不同传代数的类似结果。A.蛋白质斑点。顶部：Tom40波段；下部：通过无染色技术在每条通道中检测到蛋白质条带。B.与未转染的标准品相比，转染的细胞系中Tom40的定量。对于每个细胞系，分别计算每次稀释的结果并取平均值。数据为平均值±SEM。
图3
图3。TOM40的亚细胞分布
A.TOM40的免疫细胞化学定位。观察TOM40的亚细胞分布就地如材料和方法所述，将细胞暴露于DAPI染色（a，蓝色）以标记细胞核，暴露于MitoTracker橙色（b，红色）以标记线粒体，暴露于抗TOM40抗体（c，绿色）。叠加显示，TOM40几乎只在对照细胞和TOM40过表达细胞的线粒体中表达。A.HeLaC-1对照细胞。B.TOM40-2细胞。B.亚细胞分离。细胞生长在145 mm的培养皿中，当培养物达到70-80%的融合时，按照材料和方法中的描述进行采集和均质。通过差速离心制备细胞组分。TOM 40通过两种细胞系（未显示）的总匀浆和每个相应部分的总匀液的Western blotting测定，如材料和方法中所述。所有样品在同一SDS-gel上分馏，并在同一印迹上显影。该图表示一个实验，该实验又重复了两次，结果相似。HMF：“重”线粒体颗粒；S1：HCF后上清液部分；LMF：“轻”线粒体颗粒；S2:LPF后上清液部分。
图4
图4。TOM40的过度表达与TOM复合物外膜蛋白TOM20、基质蛋白HSPA9/GPR75/莫他林、PDHE1α和α-酮戊二酸脱氢酶以及内膜复合物I和复合物IV的水平增加有关
细胞在100 mm培养皿中生长至75–80%的汇合处，并按照材料和方法（A，B）中的描述提取用于Western blot分析，或在月桂基麦芽糖苷洗涤剂溶液（Abcam，C）中提取并使用Abcam提供的试剂盒用于A-KDGH、复合物I和复合物IV的活性测定，根据制造商的说明。用于（A）Western blot数据。按照材料和方法中的描述对系列稀释液进行分析。在同一凝胶中分离HSPA9（~75kD）和PDHE1α（~42kD），并将其印在PVDF膜上。分别分析Tom20并将其印在甲基纤维素上。（B） 免疫印迹定量。数据为所示每个实验中四种（Tom20）或三种稀释液的平均值±SD。（C） αKDGH（C1）、复合物I（C2）或复合物IV（C3）的活性。在相同的凝胶A、B或相同的酶分析（C）中同时分析两种细胞系。显示了具有代表性的数据。每个实验使用来自独立细胞传代的细胞提取物重复三次，结果相似。
图4
图4。TOM40的过度表达与TOM复合物外膜蛋白TOM20、基质蛋白HSPA9/GPR75/莫他林、PDHE1α和α-酮戊二酸脱氢酶以及内膜复合物I和复合物IV的水平增加有关
细胞在100 mm培养皿中生长至75–80%的汇合处，并按照材料和方法（A，B）中的描述提取用于Western blot分析，或在月桂基麦芽糖苷洗涤剂溶液（Abcam，C）中提取并使用Abcam提供的试剂盒用于A-KDGH、复合物I和复合物IV的活性测定，根据制造商的说明。用于（A）Western blot数据。按照材料和方法中的描述对系列稀释液进行分析。将HSPA9（~75kD）和PDHE1α（~42kD）在同一凝胶中分级并印迹到PVDF膜上。分别分析Tom20并将其印在甲基纤维素上。（B） 免疫印迹定量。数据为所示每个实验中四种（Tom20）或三种稀释液的平均值±SD。（C） αKDGH（C1）、复合物I（C2）或复合物IV（C3）的活性。在相同的凝胶A、B或相同的酶分析（C）中同时分析两种细胞系。显示了具有代表性的数据。每个实验用独立细胞传代的细胞提取物重复三次，结果相似。
图5
图5。TOM40和TOM20水平呈正相关
在HeLaC-1、TOM40-1和未转染对照HeLa细胞的提取物中同时测定TOM40和TOM20，这些细胞是在25或5 mM葡萄糖存在下生长的，并且是从亚融合或融合培养物中获得的。每个点代表一个提取。
图6
图6。MitoTracker Green染色（A）和自体溶酶体（B）检测
（A） ●●●●。在对照组和TOM40过表达细胞中，MitoTracker-Green染色是相同的。96孔板接种12×10三细胞/孔。电镀后24小时，用含有150 nM MitoTracker绿的丙酮酸和苹果酸补充的EBSS替换生长培养基，并在37°C下培养1小时后测定荧光，如材料和方法中所述。（B） ●●●●。低浓度FCCP的暴光暴露在HeLaC-1对照组和TOM40-1过表达细胞中均诱发自噬。在对照细胞中，有一个不明显的趋势，即液泡染色更大。将细胞接种到96个平板中，并按照材料和方法中的描述用FCCP处理。对于（A）和（B），所示数据为单个实验中n=8口井的平均值±StDev，并通过双向t检验进行了分析。
图7
图7。基础ATP、线粒体膜电位和耗氧量
TOM40过表达细胞的细胞ATP（A）、呼吸（B）和线粒体膜电位（C）的基础水平高于对照组。我们用12×10的种子播种96个板子三细胞/孔，24小时后，我们用EBSS替换生长培养基，不含或含有指示的FCCP浓度。两小时后，我们测量了ATP和TMRM荧光（A，B）。我们在另一组中启动了耗氧量读数。我们测量了MitoXpress磷光两个小时，如材料和方法中所述，数据表示耗氧曲线的线性部分。对于所有三个面板，所示数据为单个实验中n=8口井的平均值±StDev，并通过双向t检验（A）或单向方差分析（ANOVA）以及Tukey的HSD检验（B，C）进行分析。
图8
图8。鱼藤酮对耗氧量、细胞ATP水平和ROS生成的影响
HeLaC-1细胞比TOM40过表达细胞对鱼藤酮抑制耗氧量更敏感。（A） 呼吸。将细胞与3μM FCCP和增加浓度的鱼藤酮一起孵育。每分钟读取一次读数，持续两小时，并按照材料和方法中的描述计算吸氧量。每个点代表各自鱼藤酮浓度的最大摄取率。为清楚起见，仅显示了n=6测定的平均值，但所有数据均用于计算各自的LogIC50和HillSlope值。实验重复了三次，每次都用一个单独的细胞板，结果相似。（B） ATP水平。LogIC50两种细胞类型中抑制细胞ATP水平的作用相同。（C） ROS水平。两种细胞类型的基本活性氧水平相同，1μM FCCP诱导两种细胞的活性氧合成程度大致相同。（C）中显示的数据是单个实验和中n=8口井的平均值±StDev。ROS数据通过单因素方差分析和Tukey的HSD测试进行分析。
图9
图9。抗霉素A对耗氧量、细胞ATP水平和ROS生成的影响
耗氧量（A）和细胞ATP水平（B）对对照细胞和过度表达细胞中抗霉素A的作用同样敏感。（C） 与TOM40过表达细胞相比，对照细胞中ROS的产生对抗霉素A更敏感。用3μM FCCP培养细胞，并增加抗霉素A的浓度。按照材料和方法中的描述测量耗氧量。每个点代表各自抗霉素A浓度的最大吸收率。为清楚起见，仅显示了n=6测定的平均值，但所有数据均用于计算各自的LogIC50值。（B） 抗霉素A抑制细胞ATP水平；IC50这两种细胞类型都是相同的。（C） 抗霉素A在HeLaC细胞中增加了细胞ROS水平，但在TOM40过表达细胞中没有。报告的LogEC50用于HeLaC细胞。
图10
图10。TOM40的过度表达保护细胞免受外源性Aβ的有丝分裂毒性和细胞毒性作用
Aβ1–42按照材料和方法中的描述制备，并将其应用于96 well板（5μM，最终浓度）中的细胞。24小时后，向培养基中添加TMRM（A）或XTT（C），并继续培养两（A，B）或四（C）小时。在指定的时间，测量TMRM荧光和XTT荧光，或提取细胞进行ATP测量，如材料和方法中所述。Aβ降低了对照HeLaC-1细胞的线粒体膜电位（A）、细胞ATP水平（B）和细胞活力（C），但不降低TOM40-1细胞。数据为单个实验中8个重复的平均值±SD，数据通过单向方差分析和Tukey的HSD检验进行分析。
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