DNA-PKcs controls calcineurin mediated IL-2 production in T lymphocytes

doi:10.1371/journal.pone.0181608

.2017年7月27日；12（7）：e0181608。

doi:10.1371/journal.pone.0181608。 2017年电子收集。

DNA-PKcs控制T淋巴细胞钙调神经磷酸酶介导的IL-2生成

阿拉·金·威斯¹, 玛丽·施卢特曼·伯丁^1 2, 理查德·H·特朗奇^三, 艾伦·J·塔克特¹, 莱尔·J·伯丁^2 三 4

附属公司

¹美国阿肯色州小石城阿肯色医科大学生物化学和分子生物学系。
²美国阿肯色州小石城阿肯色医科大学外科研究部。
^三美国阿肯色州小石城阿肯色医科大学外科。
⁴美国加州大学旧金山分校移植外科。

PMID： 28750002
预防性维修识别码：项目编号C5531461
内政部： 10.1371/日记.pone.0181608

DNA-PKcs控制T淋巴细胞钙调神经磷酸酶介导的IL-2生成

阿拉·金·威斯等。公共科学图书馆一号. 2017.

.2017年7月27日；12（7）：e0181608。

doi:10.1371/journal.pone.0181608。 2017年电子收集。

作者

阿拉·金·威斯¹, 玛丽·施卢特曼·伯丁^1 2, Richard H Turnage公司^三, 艾伦·J·塔克特¹, 莱尔·J·伯丁^2 三 4

附属公司

¹美国阿肯色州小石城阿肯色医科大学生物化学和分子生物学系。
²美国阿肯色州小石城阿肯色医科大学外科研究部。
^三美国阿肯色州小石城阿肯色医科大学外科。
⁴美国加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学移植外科。

PMID： 28750002
预防性维修识别码：项目编号C5531461
内政部： 10.1371/新闻稿.0181608

摘要

哺乳动物中DNA-依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-PKcs）活性的丧失会导致严重的联合免疫缺陷（SCID）。这种SCID表型被认为完全是由于DNA-PKcs在V（D）J重组中的作用，而V（D，J）重组是淋巴细胞成熟的关键过程。然而；我们表明，DNA-PKcs是通过调控钙调神经磷酸酶信号通路产生IL-2所必需的。通过shRNA或抑制剂降低活化T细胞中DNA-PKcs的活性，通过阻断钙调神经磷酸酶活性和NFAT向细胞核的转运，显著降低IL-2的产生。此外，我们发现DNA-PKcs通过激活已知的Cabin1调节蛋白激酶CHK2，改变内源性钙调神经磷酸酶抑制剂Cabin1的表达，从而对钙调神经蛋白产生影响。DNA-PKcs作为IL-2产生的一种有效调节因子的发现将推动临床上对该酶小分子抑制作用的继续研究。

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竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。抑制T细胞和PBMC中的DNA-PKcs可阻止IL-2的产生。**
A）用不同浓度的DNA-PKcs抑制剂NU7441处理Jurkat细胞48小时，未检测到活性显著降低。B）用PMA（50 ng/mL）+PHA（1μg/mL）刺激Jurkat细胞，用NU7441处理，24小时后分析IL-2的产生。NU7441治疗显著阻断IL-2分泌。C） NU7441治疗抑制了用抗CD28/CD3动态粒以1:1的比例激活Jurkat细胞24小时后产生的IL-2。D） western blot分析显示，在2.5和5μg剂量下，shRNA处理Jurkat细胞可降低DNA-PKcs的表达。DNA-PKcs表达缺失显著降低了IL-2的产生。E） NU7441显著降低PBMC中PHA+PMA激活后IL-2的生成。**p<0.002***p<0.001误差棒=标准差。

**图2。抑制DNA-PKcs可阻断NFAT向细胞核的移位。**
A） Jurkat细胞裂解物的Western blot分析显示，PMA+PHA在s2056位点诱导DNA-PKcs磷酸化（pDNA-PK），在s237位点诱导去磷酸化NFAT（pNFAT），激活T细胞。用NU7441处理抑制了NFAT在s237位点的去磷酸化，这对NFAT向细胞核的转运至关重要。GAPDH被用作负荷控制。B） NU7441处理Jurkat细胞的免疫细胞化学分析。抑制剂（2.5μM）在PMA+PHA激活后阻止NFAT向细胞核的移位。细胞核用Dapi染色。显示了40张图像。

**图3。DNA-PKcs抑制剂阻断T细胞中的钙调神经磷酸酶活性。**
A）用PMA+PHA激活Jurkat细胞，用DNA-PKcs抑制剂NU7441（2.5μM）处理，并监测钙调磷酸酶活性。抑制导致钙调神经磷酸酶活性显著降低。B）钙水平²⁺监测PMA+PHA激活后Jurkat细胞裂解物。钙²⁺添加NU7441抑制剂不会影响水平。C）激活Jurkat细胞中活性磷酸化mTOR的Western blot和Elisa分析表明，抑制DNA-PKcs不会改变mTOR激活***p<0.001误差线=标准差。

**图4。抑制DNA-PKcs可减少CHK2的磷酸化并稳定钙调神经磷酸酶抑制剂Cabin1。**
A）用PMA+PHA和NU7441处理活化后Jurkat裂解物的Western blot分析。活化增加了DNA-PKcs和CHK2的磷酸化。DNA-PKcs抑制降低CHK2磷酸化并升高Cabin1表达。GAPDH被用作负荷控制。B）描述DNA-PKcs用于调节IL-2生成的T细胞信号通路的示意图。DNA-PKcs磷酸化CHK2，CHK2反过来磷酸化Cabin1，将其靶向破坏。这减轻了钙调神经磷酸酶抑制，导致NFAT和IL-2产生的移位增加。钙调神经磷酸酶。

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[1] Burma S，Chen DJ。DNA-PK在细胞对DNA双链断裂反应中的作用。DNA修复2004；3(8–9):909–18. 数字对象标识：2016年10月10日/j.dnarep.2004.03.021-内政部-公共医学

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[7] Taccioli GE、Amatucci AG、Beamish HJ、Gell D、XH、Torres Arzayus MI等。小鼠DNA-PK基因催化亚基的靶向破坏导致严重的免疫缺陷和放射敏感性。1998年豁免；9(3):355–66.-公共医学

[8] Taccioli GE、Amatucci AG、Beamish HJ、Gell D、XH、Torres Arzayus MI等。小鼠DNA-PK基因催化亚基的靶向破坏导致严重的免疫缺陷和放射敏感性。1998年豁免；9(3):355–66.-公共医学

[9] Jhappan C、Morse HC、3rd、Fleischmann RD、Gottesman MM、Merlino G.DNA-PKcs：一种在小鼠scid位点编码的T细胞肿瘤抑制因子。Nat Genet 1997；17(4):483–6. 数字对象标识：10.1038/ng1297-483-内政部-公共医学

[10] Jhappan C、Morse HC、3rd、Fleischmann RD、Gottesman MM、Merlino G.DNA-PKcs：一种在小鼠scid位点编码的T细胞肿瘤抑制因子。Nat Genet 1997；17(4):483–6. 数字对象标识：10.1038/ng1297-483-内政部-公共医学

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