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.2017年9月15日;292(37):15489-15500.
doi:10.1074/jbc。M117.806000。 Epub 2017年7月25日。

CDK9和SPT5蛋白是单纯疱疹病毒1复制依赖性晚期基因表达的特异性必需蛋白

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CDK9和SPT5蛋白是单纯疱疹病毒1复制依赖性晚期基因表达的特异性必需蛋白

赵志远等。 生物化学杂志. .

摘要

DNA复制通过未知机制大大增强了单纯疱疹病毒1(HSV-1)γ2晚期基因的表达。在这里,我们证明了5,6-二氯-1-β-d-呋喃核糖基苯并咪唑(DRB),一种CDK9的抑制剂,通过IC抑制γ2晚期基因的表达505μm,至少比IC低10倍50抑制早期基因表达所需的值。DRB的作用不能用抑制DNA复制来解释就其本身而言或将RNA聚合酶II加载到晚期启动子并随后减少转录。相反,DRB减少了细胞质中γ2晚期mRNA的积累。此外,我们发现siRNA-介导的转录因子SPT5的敲除,而非NELF-E,也会引起HSV-1晚期基因表达的特异性抑制。最后,添加DRB可使用抗SPT5抗体减少ICP27的联合免疫沉淀。我们的结果表明,复制依赖性γ2晚期基因的有效表达至少部分受到CDK9依赖性共转录和/或涉及SPT5和ICP27的转录后事件的调控。

关键词:细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK);基因表达;疱疹病毒;转录后调控;病毒复制。

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利益冲突声明

作者声明,他们与本文的内容没有利益冲突

数字

图1。
图1。
向HSV-1启动子招募RNA聚合酶II。ChIP对抗RNA聚合酶II(零售物价指数)在HSV-1感染的1BR.3.N细胞中,使用WT病毒或ICP4缺陷的突变病毒tsK或UL9蛋白缺陷的tsS进行检测。细胞在感染后0小时在非允许温度下使用7的m.o.i进行感染(马力。). 它们在指定的时间点收获。将每个ChIP实验获得的值归一化为1 h.p.i的值。显示两个独立实验的平均值误差线指示变化。
图2。
图2。
DRB对早期(UL39)和晚期(UL38)基因上RNA聚合酶II分布的影响。对37°C下感染HSV-1的1BR.3.N细胞进行了针对RNA聚合酶II的ChIP,检测的m.o.i为10。在0小时将病毒添加到细胞中,并在指定的时间点采集细胞。进行了三个独立的实验,并使用UL39启动子作为参考,对每个实验的单个观察值进行了标准化。计算每个实验点的平均值误差线显示标准偏差。在没有DRB的情况下进行的实验()并且在25μDRB(争议评审委员会)(b).
图3。
图3。
DRB对晚期而非早期基因表达的抑制伴随着HSV-1 DNA复制的延迟。 a、,用免疫印迹法检测HSV-1基因在37°C条件下表达的时间进程,m.o.i为1。实验在有无25μDRB(争议评审委员会)。b、,免疫印迹法检测基因表达。显示了两个独立实验的平均值。c、,在三个独立的实验中,用qPCR检测HSV-1的DNA复制。这个误差线显示标准偏差。
图4。
图4。
IC的确定50用于DRB和黄哌啶醇的早期和晚期基因表达。在有DRB存在的情况下,通过免疫印迹法在19 h.p.i.、1 m.o.i.下测量HSV-1基因表达(b)或黄哌啶醇(c(c))在指示的浓度下。c、,量化显示了两个实验的平均值,并将其归一化为模拟治疗感染。b、,三个独立实验中蛋白质表达的量化,以及误差线表示标准偏差。
图5。
图5。
siRNA介导的CDK9、SPT5和NELF-E敲低对HSV-1基因表达和DNA复制的影响。CDK9的siRNA(),SPT5(b)和NELF-E(c(c))用于1BR.3.N细胞的敲除实验。敲低后,用HSV-1感染细胞,并收获19h.p.i.用于免疫印迹或qPCR。相比之下,在没有DRB和有DRB的情况下,没有敲除的细胞被HSV-1感染,同时进行敲除实验。每个实验进行三次独立的重复,平均值显示在图表中。误差线表示标准偏差。
图6。
图6。
DRB对HSV-1早期和晚期转录物的影响,并且DRB仍然可以对添加7 h.p.i的晚期基因表达发挥完全抑制作用。 a、,通过多重RT-qPCR在感染HSV-1的细胞中以1的m.o.i.检测UL38和UL23 mRNA的比率。然后是25μDRB与未受干扰的感染同时加入1h p.i。在指定的时间采集细胞。显示了三个独立实验的平均值误差线指出标准偏差。b、,ICP8、糖蛋白C和肌动蛋白的表达通过Western blotting在37°C、19 h.p.i.、1 m.o.i.下进行测定。添加25μ的时间显示了培养基的DRB。c、,通过高通量RNA测序分析感染HSV-1的细胞中的HSV-1转录组。在没有DRB的情况下对感染细胞进行测序(红色)在提供25μ7 h.p.i.时的DRB(蓝色). 结果表示为相对于映射到该基因的读取总数,映射到特定位置的读取数之间的比率。
图7。
图7。
DRB减少HSV-1 mRNA的细胞质积累和与SPT5共免疫沉淀的ICP27数量。 a、,1BR.3.N细胞以1。从亚细胞分离获得的核质组分中分离出RNA。在四个独立的实验中,在19 h.p.i.通过多重RT-qPCR测定细胞质和细胞核中UL38和UL23 mRNA的比率。结果显示为存在时细胞质和细胞核比率之间商的平均值(黑色)或缺少25μDRB(争议评审委员会)(灰色)、和误差线表示标准偏差。非配对双尾Student’s确定的统计显著性t吨方差不等的检验是第页= 0.0074.b、,使用HSV-1感染的HeLa细胞提取物进行的抗SPT5免疫沉淀实验的免疫印迹。这些细胞在10个m.o.i.感染后,用25μDRB或DMSO在1 h.p.i.。在17 h.p.i,收集细胞并提交至抗SPT5免疫沉淀。c、,三个独立免疫沉淀实验的量化。计算在存在或不存在DRB的情况下进行的实验中测得的ICP27和SPT5的量之间的比率。在没有DRB的情况下获得的比率用于归一化。这个误差线表示标准偏差。

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