microRNA-mediated differential expression of TRMU, GTPBP3 and MTO1 in cell models of mitochondrial-DNA diseases

doi:10.1038/s41598-017-06553-w

.2017年7月24日；7(1):6209.

doi:10.1038/s41598-017-06553-w。

微小RNA介导的线粒体-DNA疾病细胞模型中TRMU、GTPBP3和MTO1的差异表达

萨尔瓦多·梅塞盖尔¹, 奥尔加博伊克斯², 卡门·纳瓦罗·冈萨雷斯², 马格达·维拉罗亚², 拉希德·布图瓦尔², 索尼娅·恩佩拉多尔^三, 埃琳娜·加西亚·阿鲁米⁴, 朱利奥·蒙托亚^三, M-Eugenia Armengod公司^5 6

附属公司

¹RNA修饰和线粒体疾病实验室，西班牙巴伦西亚费利佩研究中心。smeseguer@cipf.es。
²RNA修饰和线粒体疾病实验室，西班牙巴伦西亚费利佩研究中心。
^三萨拉戈萨大学-CIBERER（节点727）-西班牙萨拉戈萨卫生研究所。
⁴希布伦山谷大学医院（西班牙巴塞罗那）和罕见病生物医学研究网络中心CIBERER，节点701，西班牙巴塞罗那。
⁵RNA修饰和线粒体疾病实验室，西班牙巴伦西亚费利佩研究中心。marmengod@cipf.es。
⁶西班牙巴伦西亚CIBERER节点721。marmengod@cipf.es。

PMID： 28740091
预防性维修识别码： PMC5524753
内政部： 10.1038/s41598-017-06553-周

微小RNA介导的线粒体-DNA疾病细胞模型中TRMU、GTPBP3和MTO1的差异表达

萨尔瓦多·梅塞盖尔等。科学代表. 2017.

.2017年7月24日；7(1):6209.

doi:10.1038/s41598-017-06553-w。

作者

附属公司

¹RNA修饰和线粒体疾病实验室，西班牙巴伦西亚费利佩研究中心。smeseguer@cipf.es。
²RNA修饰和线粒体疾病实验室，西班牙巴伦西亚费利佩研究中心。
^三萨拉戈萨大学-CIBERER（节点727）-西班牙萨拉戈萨卫生研究所。
⁴希布伦山谷大学医院（西班牙巴塞罗那）和罕见病生物医学研究网络中心CIBERER，节点701，西班牙巴塞罗那。
⁵RNA修饰和线粒体疾病实验室，西班牙巴伦西亚费利佩研究中心。marmengod@cipf.es。
⁶西班牙巴伦西亚CIBERER节点721。marmengod@cipf.es。

PMID： 28740091
预防性维修识别码： PMC5524753
内政部： 10.1038/s41598-017-06553-周

摘要

线粒体DNA突变导致的线粒体疾病在临床表现上是异质性的，但通常包括OXPHOS功能障碍。OXPHOS功能障碍导致疾病表型的机制除了引起细胞能量不足外，还引发了对线粒体-细胞核逆行信号的适应不良反应。在这里，我们使用了五种不同的mtDNA疾病杂交模型来证明核编码的mt-tRNA修饰酶TRMU、GTPBP3和MTO1的表达随着特定的病理性mtDNA突变而变化，从而改变mt-tRNA的修饰状态。重要的是，我们证明了TRMU、GTPBP3和MTO1的表达受不同的miRNAs调控，这些miRNAs-由ROS和Ca等逆行信号诱导²⁺通过不同的途径。我们的数据表明，mt-tRNA修饰酶的上调或下调是细胞应对mtDNA和核编码OXPHOS亚单位之间化学计量失衡的反应的一部分。然而，这种miRNA-介导的反应未能对OXPHOS功能障碍提供充分保护；相反，它似乎会加重表型，因为用miRNA拮抗剂转染突变的cybridges可以改善细胞的能量状态，这为新的治疗方法开辟了选择。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
携带MELAS、MERRF、m.5514的杂交细胞线粒体特征的改变 A类 > G（mt-tRNA^Trp公司)，m.1643A > G（mt-tRNA^瓦尔)，和m.14487 T型 > C（ND6）突变。(A类)突变型和野生型（WT）杂交细胞中LONP1、AFG3L2和CLPP肽酶的代表性western blot。以孔蛋白作为负荷控制，对膜进行了检测。补充信息中包括孔蛋白的全长western印迹和低暴露印迹。(B类)LONP1、AFG3L2和CLPP的密度分析归一化为孔蛋白，并表示为相对于WT的褶皱变化（顶部）。定量数据来自至少三个独立实验。此分析的结果也显示为热图（底部）。日志中的颜色和相应值₂比例如左图所示。(C类)突变细胞和WT杂交细胞中OXPHOS复合物的代表性蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳。补充信息中包括高对比度的全长印迹和低曝光印迹。(天)OXPHOS络合物归一化为络合物II（负载控制）的密度分析，表示为相对于WT的折叠变化(E类)突变细胞和WT杂交细胞中的细胞ATP测定。(F类和**G公司**)钙的测定²⁺(F类)和活性氧(**G公司**)用流式细胞术分别检测突变细胞和WT细胞与Fluo-3和MitoSOX红的杂交细胞。所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SEM。与WT值的差异在*p时具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001.

图2
不同杂交细胞中U34修饰酶的特定表达模式。(**A–C**)qRT-PCR分析*GTPBP3号机组*(A类),*MTO1公司*(B类)和*TRMU公司*(C类)突变体和WT杂交细胞中的mRNA表达。(天)突变细胞和WT杂交细胞中GTPBP3、MTO1和TRMU的Western blot分析。以孔蛋白作为负荷控制，对膜进行了检测。补充信息中包括全长蛋白质印迹。(E类)GTPBP3、MTO1和TRMU的密度分析标准化为孔蛋白，并表示为相对于WT的倍数变化（顶部）。此分析的结果也显示为热图（底部）。日志中的颜色和相应值₂比例如左图所示。所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SEM。在*p时，发现与WT值的差异具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001之间。AU：任意单位。

图3
mt-tRNA的2-硫酰化状态^赖氨酸取决于TRMU表达水平。(A类)mt-tRNA 2-硫代化状态的APM-Northern分析^赖氨酸从突变和WT杂交细胞中获得。相同数量的总RNA（7.5 µg）在存在（+）或不存在（-）APM的变性聚丙烯酰胺-尿素凝胶中运行。在APM存在下，硫代化tRNA被检测为延迟带。APM（−）膜也用5S rRNA作为负荷对照进行了探测。(B类)mt-tRNA的相对稳态水平^赖氨酸.与mt-tRNA数量相对应的信号^赖氨酸在APM（−）膜中，标准化为与5S rRNA量相对应的信号，并表示为相对于WT的折叠变化。APM（+）膜的全长印迹和低暴露印迹包含在补充信息中。(C类)硫代和非硫代mt-tRNA的百分比^赖氨酸物种与该mt-tRNA总量的比较。每个部分（硫代或非硫代）的定量表示为其信号占总信号（硫代 + 非硫代信号）。所有数据均表示平均值 ± 至少三个不同实验的SD。在*p时，发现与WT值的差异具有统计学意义 < 0.05.

图4
靶向U34修饰酶的miRNAs的突变依赖性表达。(**A–D**)miR-9/9*的qRT-PCR分析(A类)，miR-338-3p(B类)和miR-335/335*(C类)突变体和WT杂交细胞中的表达。此分析的结果也显示为热图(天). 日志中的颜色和相应值₂比例如左图所示。所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SEM。与WT值的差异在*p时具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001之间。AU：任意单位。

图5
miR-9/9*、miR-338-3p和miR-335/335*是U34修饰酶的调节器。**（A–D）**qRT-PCR（左）和Western blot（右）分析*GTPBP3、MTO1*和*TRMU公司*抗miR-9转染MERRF细胞的表达(A类)，抗miR-338-3p转染的MELAS细胞(B类)，抗miR-335转染的m.Trp细胞(C类)和抗miR-335转染的m.Val细胞(天)，以及在各自的阴性对照（NC）转染的细胞中(**A–D**). 补充信息中包括全长蛋白质印迹。**（E）**miR-335转染对直接（+）或反向（−）含有GTPBP3-3′-UTR的荧光素酶报告体活性的影响。(F类)miR-335*转染对直接（+）或反向（-）方向含有MTO1-3′-UTR的荧光素酶报告体活性的影响。(**G公司**和**H（H）**)miR-338-3p转染对含有GTPBP3-3′-UTR的荧光素酶报告基因结构活性的影响(**G公司**)和TRMU-3′-UTR(**H（H）**)在直接（+）或反向（−）方向。所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SEM。发现与NC值的差异在*p具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001之间。RLU：相对灯光单位。

图6
miR-9/9*、miR-338-3p和miR-335/335*的诱导使杂交系的能量状态恶化。(**A–E**)抗miR-9转染的MELAS细胞中细胞ATP的测定(A类)，抗miR-9转染的MERRF细胞(B类)，抗miR-335转染的m.Trp细胞(C类)，抗miR-335转染的m.Val细胞(天)、抗miR-338-3p转染的MELAS细胞（E）和相应的阴性对照（NC）-抗miR转染细胞(**A–E**).（F）mt-tRNA 2-硫代化状态的APM-Northern分析^赖氨酸从转染抗miR-9或NC-anti-miR的MELAS细胞获得。在APM存在的情况下，巯基化tRNA被检测为延迟带。用5S rRNA作为负荷对照，对膜进行探测。mt-tRNA的全长印迹和低暴露印迹^赖氨酸包含在补充信息中。**（G）**硫代和非硫代mt-tRNA的百分比^赖氨酸物种与该mt-tRNA总量的比较。每个部分（硫代或非硫代）的定量表示为其信号占总信号（硫代 + 非硫代信号）。所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SEM。在*p时，发现与阴性对照（NC）值的差异具有统计学意义 < 0.05和**p < 0.01.

图7
活性氧和细胞内钙水平升高²⁺刺激突变杂交细胞中miR-9/9*和miR-335/335*的表达。(**A–D**)miR-9和miR-335*在MELAS中表达的qRT-PCR分析(A类)、MERRF(B类)、m.Trp、m.Val(C类)和m.ND6(天)用1处理的杂交细胞 mM NAC（抗氧化剂）48 h或10μM BAPTA（Ca²⁺螯合剂）2 h.所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SEM。在*p时，发现与WT值的差异具有统计学意义 < 0.05和**p < 0.01.

图8
用Thapsigargin或H处理m.Trp和m.Val杂交后代₂O（运行）₂触发miR-9的表达并降低TRMU水平。(A类)miR-9和miR-335在m.Trp、m.Val和WT杂交细胞中表达的qRT-PCR分析 24小时的nM Thapsigargin（THAP） h或5 毫米高₂O（运行）₂用于6 小时(B类)用qRT-PCR分析400或400处理的m.Trp、m.Val和WT杂交细胞中TRMU mRNA的表达 24小时的nM Thapsigargin（THAP） h或5 毫米高₂O（运行）₂用于6 小时(C类)经400或400处理的m.Trp、m.Val和WT杂交细胞中TRMU表达的代表性western blot 24小时的nM Thapsigargin（THAP） h（左）或5 毫米高₂O（运行）₂用于6 h（右）。以孔蛋白作为负荷控制，对膜进行了检测。补充信息中包括全长蛋白质印迹。(天)TRMU归一化为孔蛋白并表示为相对于WT的褶皱变化的密度分析。所有数据均为平均值 ± 至少三个不同实验的SEM。与WT值的差异在*p时具有统计学意义 < 0.05，**p < 0.01和***p < 0.001.

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