Actomyosin drives cancer cell nuclear dysmorphia and threatens genome stability

doi:10.1038/ncomms16013

.2017年7月24日：8:16013。

doi:10.1038/ncomms16013。

肌动球蛋白导致癌细胞核畸形并威胁基因组稳定性

附属公司

¹英国赫特福德郡EN6 3LD南米姆斯克莱尔霍尔实验室，英国伦敦癌症研究所，细胞部和非整倍体实验室。
²DSB修复代谢实验室，弗朗西斯·克里克研究所，1 Midland Road，London NW1 1AT，UK。
³英国伦敦NW1 1AT米德兰路1号弗朗西斯·克里克研究所肿瘤细胞生物学实验室。
⁴英国伦敦WC1E 6BT高尔街UCL分子细胞生物学MRC实验室。
⁵巴黎皇家科学院巴黎研究院居里研究所，法国巴黎，邮编：F-75005，UMR 144。
⁶英国伦敦NW1 1AT米德兰路1号弗朗西斯·克里克研究所电子显微镜组。
⁷分子细胞生物学系，LUMC，Einthovenweg 20，2333 ZC Leiden，The Netherlands。
⁸高通量筛选实验室，Francis Crick Institute，1 Midland Road，London NW1 1AT，UK。
⁹博林格·英格尔海姆RCV GmbH&Co KG，Dr Boehringer Gasse 5-11，A-1121 Vienna，Austria。

PMID： 28737169
预防性维修识别码： PMC5527285
内政部： 10.1038/ncomms16013

肌动球蛋白导致癌细胞核畸形并威胁基因组稳定性

托鲁·塔卡基等。国家公社. 2017.

.2017年7月24日：8:16013。

doi:10.1038/ncomms16013。

附属公司

¹英国赫特福德郡EN6 3LD南米姆斯克莱尔霍尔实验室，英国伦敦癌症研究所，细胞部和非整倍体实验室。
²DSB修复代谢实验室，弗朗西斯·克里克研究所，1 Midland Road，London NW1 1AT，UK。
³英国伦敦NW1 1AT米德兰路1号弗朗西斯·克里克研究所肿瘤细胞生物学实验室。
⁴英国伦敦WC1E 6BT高尔街UCL分子细胞生物学MRC实验室。
⁵巴黎皇家科学院巴黎研究院居里研究所，法国巴黎，邮编：F-75005，UMR 144。
⁶英国伦敦NW1 1AT米德兰路1号弗朗西斯·克里克研究所电子显微镜组。
⁷分子细胞生物学系，LUMC，Einthovenweg 20，2333 ZC Leiden，The Netherlands。
⁸高通量筛选实验室，Francis Crick Institute，1 Midland Road，London NW1 1AT，UK。
⁹博林格·英格尔海姆RCV GmbH&Co KG，Dr Boehringer Gasse 5-11，A-1121 Vienna，Austria。

PMID： 28737169
预防性维修识别码： PMC5527285
内政部： 10.1038/ncomms16013

摘要

核形状改变是癌细胞的一个特征。癌症核形态异常的潜在机制仍不清楚。在此，我们确定PPP1R12A和PPP1CB是肌球蛋白磷酸酶复合体的两个亚单位，可对抗肌动球蛋白收缩性，作为保护核完整性的蛋白质。PPP1R12A或PPP1CB的缺失会导致核碎裂、核膜破裂、核室破裂和基因组不稳定。在缺乏PPP1R12A或PPP1CB的细胞中，肌动球蛋白收缩性的药理或基因抑制可恢复核结构和基因组完整性。我们在核膜破裂部位检测到肌动蛋白丝，并将Rho-ROCK途径定义为核损伤的驱动因素。层粘连蛋白A保护细胞核免受肌动蛋白活性的影响。阻断收缩性可增加培养的癌细胞的核循环，并抑制体内异种细胞核的变形。我们的结论是，肌动球蛋白的收缩性是核形状的主要决定因素，无限制的收缩性会导致核畸形、核膜破裂和基因组不稳定。

PubMed免责声明

利益冲突声明

M.P.是Boehringer Ingelheim RCV的一名员工，并声明没有与本作品相关的竞争利益。其余作者声明没有竞争财务利益。

数字

**图1。PPP1R12A和PPP1CB的耗尽导致核变形和核膜破裂。**
(一–**c（c）**)转染PPP1R12A或PPP1CB siRNA的HeLa Kyoto细胞被固定56 转染后h。(一)用指示的核膜标记物和DAPI（左面板）对细胞进行染色。表型量化（右上面板）。siRNA-转染细胞的免疫印迹分析（右下图）。对异常核形状（变形）和核膜不连续性（破裂）进行了量化。三个独立实验的误差条标准偏差(n个>每个电池200个）。(b条)用DAPI对PPP1R12A和PPP1CB siRNA-转染细胞进行染色，并计算每个细胞核的核圆度（左侧面板）。红色条表示三个实验的平均值和标准差。图中显示了具有代表性的核形状及其圆度指数（右面板）。三个独立实验的误差条标准偏差(n个>每个核100个）。(**c（c）**)免疫荧光染色分析PML在PPP1R12A缺失细胞中的定位。填充的箭头表示细胞质PML信号。从三个独立实验中获得的百分比(n个>每个200个细胞）。显示了三个实验的平均值±标准误差。(d日)瞬时表达AcGFP-NES和mCherry-NLS的PPP1R12A-siRNA-转染HeLa-Kyoto细胞的时间推移显微镜（左面板）。录制已开始40 转染后h（0 最小值）。细胞核和细胞质中的mCherry-NLS信号强度随时间变化而定量（右图）。填充的箭头表示核破裂事件，其特征是mCherry-NLS从细胞核突然流出进入细胞质。中的图形一,b条显示*****P（P）*<0.0001 (一χ²测试，b条单向方差分析Tukey多重比较试验）。比例尺，10 微米。

**图2。肌动球蛋白的收缩性驱动PPP1R12A和PPP1CB-depleted细胞的核变形和破裂。**
(一)收获了HeLa京都细胞56 在用指示的siRNA双链体转染后h，并通过定量免疫印迹进行分析。(b条,**c（c）**)转染非靶向对照、PPP1R12A或PPP1CB siRNA的HeLa-Kyoto细胞被固定56 转染后h进行免疫荧光分析。(b条)用5 μM抑泡素，5 微米Y-27632，10 μM ML-7或0.4 微克毫升⁻¹24小时C3毒素固定前h。顶部面板显示了具有代表性的免疫荧光图像。底部面板中量化了异常核形状（变形）和核膜不连续性（破裂）。比例尺，10 微米。(**c（c）**)使用从b条三个独立实验的误差条(n个>每个电池200个）(b条,**c（c）**). 图表显示*****P（P）*<0.0001（单向方差分析-Tukey多重比较试验）。

**图3。MRLC磷酸化的放松调节导致异位肌动球蛋白纤维形成和核变形。**
(一)用编码EGFP、MRLC-EGFP野生型或MRCL-EGFP T18A S19A（TASA）的慢病毒颗粒转导HeLa-Kyoto细胞。15 感染后h，用指示的siRNA双链转染细胞并进行免疫荧光分析56 转染后h。仅对EGFP信号阳性细胞进行评分。显示了代表性细胞图像（左图）和细胞核表型的定量（右图）。(b条)用编码MRLC-EGFP野生型或T18D S19D突变（TDSD）的慢病毒颗粒感染HeLa Kyoto细胞，并进行免疫荧光分析56 感染后h。仅对EGFP信号阳性细胞进行评分。显示了代表性细胞图像（左面板）和核表型定量（右面板）。(**c（c）**)PPP1R12A缺失细胞被固定，并用抗层粘连B1抗体、DAPI和荧光结合的卵磷脂进行染色。在0.1中扫描细胞 μm切片。使用Imaris软件重建并渲染3D图像。三个独立实验的误差条标准偏差(n个>每个电池200个）(一,b条). 比例尺，10 微米。

**图4。PPP1R12A缺失对核形态的影响*LMNA公司*−/−和患者衍生细胞。**
(一)*LMNA公司*+/+和−/−小鼠胚胎成纤维细胞用所示的siRNA双链体转染并用DAPI56染色转染后h。细胞暴露于二甲基亚砜溶剂控制或5 μM布利他汀24小时固定前h。图中显示了具有代表性的图像（左面板）和核圆度量化（右面板）。三个独立实验的误差条标准偏差(n个>每个核100个）。比例尺，10 微米。(b条)将指定的siRNA转染外阴鳞癌细胞（VSCC10）和外阴癌相关成纤维细胞（VCAF10）原代细胞48个 h.显示代表性细胞图像（左面板）和核表型定量（右面板）（VSCC10 siControl；n个=100，siPPP1R12A；n个=82，VCAF10 siControl；n个=89，siPPP1R12A；n个=每个条件78个单元格）。比例尺，20 微米。图表显示*****P（P）*<0.0001 (一未成对的t吨测试；b条χ²测试）。

**图5。肌动球蛋白的收缩性是核形状和动力学的决定因素。**
(一)来自不同组织的癌细胞系用5 μM布利他汀24小时 h、固定并用DAPI染色。图中显示了乳腺癌细胞系MDA-MB-231（右面板）的核圆形量化（左面板）和代表性图像。三个独立实验的误差条标准偏差(n个>每个核100个）。比例尺，10 微米。(b条)表达AcGFP-LAP2β和H2B-mCherry的MDA-MB-231异种移植瘤的活体内成像。胶原蛋白显示为蓝色。比例尺，20 微米。(**c（c）**)表达AcGFP-LAP2β和H2B-mCherry的MDA-MB-231肿瘤的活体内延时序列。箭头表示潜在的核外壳破裂事件。图像代表30个字段微米×30 微米。比例尺，10 微米。(d日)定量活体MDA-MB-231成像电影中的核周长、圆度和长宽比随时间的变化(**c（c）**). 绘制对照组和Y-27632治疗肿瘤的单个细胞的方差值（对照组；n个=32，Y-27632；n个=每个37个单元格）。图表显示****P（P）*=0.0002, *****P（P）*<0.0001（未配对t吨测试）。

**图6。无限制肌动球蛋白活性诱导DNA损伤标记物。**
(一,b条)对转染非靶向对照（siControl）或PPP1R12A-siRNA双链体的HeLa-Kyoto细胞进行免疫荧光染色56 转染后h。(一)用5 μM Y-27632或400 nM蚜虫灵24小时固定前h。用抗γ-H2AX抗体和DAPI对细胞进行染色。图中显示了具有代表性的图像（左侧面板）和γ-H2AX核信号强度的量化（右侧面板）。绘制单个细胞的平均核强度。(b条)用抗53BP1抗体和DAPI对细胞进行染色。显示了53BP1阳性细胞的代表性图像（左侧面板）和量化（右侧面板）。具有5个以上53BP1病灶的细胞被评为53BP1阳性细胞。(**c（c）**)转染siPPP1R12A的HeLa细胞用抗层粘连蛋白B1、γ-H2AX和DAPI染色。三个独立实验的误差条标准偏差(n个>每个核100个）(一和b条). 图表显示*****P（P）*<0.0001 (一单因素方差分析-Tukey多重比较检验；b条未成对的t吨测试）。比例尺，10 微米。

**图7。PPP1R12A缺失导致收缩性依赖性的总染色体畸变。**
用5 24μM Y-27632 固定前h。经330处理后，通过摇晃收集有丝分裂细胞 nM诺科达唑和2 5毫升咖啡因 h.通过染色体扩散和Giemsa染色分析有丝分裂染色体。示例核型（左侧面板）和异常染色体核型的量化（右侧面板）显示。三个独立实验的误差条标准偏差(n个>300张）。图表显示****P（P）*=0.0001, *****P（P）*<0.0001（单向方差分析-Tukey多重比较试验）。比例尺，10 微米。

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