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.2017年7月19日；7(1):5899.
doi:10.1038/s41598-017-05614-4。

临床清晰的途径：发育和疾病中不规则、软组织和异质组织的体积分析

布赖恩·休赫 1, 凡妮莎·M·伯恩斯 2, 菲利普·鲍尔斯坦 三, 凯瑟琳·霍尔泽姆 4, 李晔 5 6, 克里斯汀·恩伯格 1, 王爱池 1, 顾雪英 三, 哈里尼·查克拉瓦尔西 三, H Efsun Arda公司 三, 格雷戈里·查维尔 7, 汉内斯·沃格尔 7, 伊戈尔·埃菲莫夫 4 8, Seung Kim先生 三 6, 卡尔·戴瑟罗 9 10 11
附属公司

临床清晰的途径：发育和疾病中不规则、软组织和异质组织的体积分析

布赖恩·休赫等。 科学代表. .

摘要

典型的薄片组织学无法很好地捕捉到三维组织结构关系，这对组织生理学和病理学的研究提出了挑战。此外，尽管最近在清洁、标记和成像整个器官（如成熟大脑）的完整方法方面取得了进展，但这些方法通常不适用于占绝大多数临床样本和活检的软组织、不规则组织和异质组织。在这里，我们开发了一种双相水凝胶方法，该方法与自动分析一起，为空间不规则和易碎组织结构的高通量定量容积查询提供了便利。我们验证并应用该方法检查各种发育中和病变组织，特别关注正常和病理性胰腺神经支配和发育的动力学，包括临床样本。与传统的薄片组织学相比，完整组织方法的定量优势得到了证明，表明其在研究和临床环境中的广泛应用。

PubMed免责声明

利益冲突声明

英国。D.是ClearLight Diagnostics的创始人和顾问，该公司正在探索CLARITY在癌症诊断中的应用。所有其他作者均声明没有相互竞争的经济利益。

数字

图1
图1
外周组织增强清晰度方法的发展。(一)简化的清晰示意图：首先，将固定组织置于水凝胶单体溶液（紫色）中，该溶液扩散至整个组织。其次，在聚合之前，样品被转移到第二个水凝胶溶液中，而没有形成固体聚合物的能力（橙色）。第三，通过氮气冲洗和脱气或使用表面油（以黄色表示）作为氧气抑制剂聚合样品，从而形成具有固体水凝胶内部但在液体溶液中的组织聚合物混合物，这是脆弱或不规则形状组织的理想选择。第四，组织是被动清除的。最后，在实现光学透明后，用分子探针（RNA、抗体或染料）标记组织，将其安装在折射率匹配溶液中的载玻片上，并使用标准显微镜成像。可以对样品进行去污，并重复多次染色和成像循环。(b条)虚拟薄截面（5 μm）与澄清体积（250 μm最大强度投影）相同的胰岛图像，此处来自Wnt1-Cre的整个P15胰腺中的代表性胰岛；ROSA-mTmG鼠标。与切片组织学相比，CLARITY能够更全面、准确地测量结构特征。薄片会严重低估胰岛的大小（虚线），导致对精细微观结构的观察不完整，例如复杂的神经投射（箭头）。(c（c）)与A1B1P4（红色）和A4B4P4（蓝色）相比，透明凝胶A4B4P0（绿色）在多种组织类型（包括大脑、肌肉、肝脏、肾脏）中的清除速度明显更快（p < 0.00005，未配对t检验）和胰腺（p < 0.0005，未配对t检验）。n个 = 每种组织类型和凝胶6个切片。通过将紫外分光光度法测量值与一级转化反应动力学方程y拟合，确定清除反应速率 = Y（Y）最大值(1 − 电子−千吨)并标准化为Brain A4B4P4。(d日)根据BCA分析测定，与单独使用PFA固定组织相比，不同的透明凝胶配方不会影响清除标本中蛋白质的损失（p < 0.00005，未配对t检验）。n个 = 每种组织类型和凝胶6个样本。(电子)A1B1P4配方提高了抗体的穿透率，导致在抗体中孵育12小时后，用标记物Parvalbumin（PV）对完整的1mm脑片进行染色。比例尺 = 100 微米。(（f）)染色质量来自(电子)通过测量由平均细胞外背景强度归一化的平均细胞信号强度来量化。n个 = 每种凝胶类型6个样品。对于所有图表，错误为s.e.m.**p < 0.005，***p < 0.0005，****磅 < 0.00005.
图2
图2
小鼠发育中的神经内分泌胰腺。(一)从E15（左）和P15（右）的Wnt1-Cre x Rosa26-mT/mG报告细胞系采集胰腺，使用CLARITY进行处理，并对其进行胰岛素染色。3D组织学使整个胰腺内发育中的胰岛（白色）和相关神经特征（绿色）在器官范围内可视化；然后使用计算管道自动处理成像数据集（见图S2）。Int：肠，Panc：胰腺，Sp：脾。所有样品均嵌入A1B1P4水凝胶，并在37℃时清除1-2周 摄氏度。比例尺 = 1000 微米。(b条)自动定量显示胰岛大小和数量在胰腺发育不同阶段的变化。注意到出生后不久胰岛数量急剧增加（p < 0.05，未配对t检验）至P6，然后减少。(c（c）)胰岛大小也不单调，总粒径减小（P6–P15，p < 0.05，未配对t检验）和生长（P15-42，p < 0.0005，未配对，t检验）。(d日)与其他时间点相比，第42页的人口向更大的岛屿转移说明了CLARITY可以实现精确的全人口测量。(电子)胰岛周围和胰岛内神经嵴结构的存在被量化。神经嵴-胰岛相互作用水平是动态的，P2和P6之间显著降低（p < 0.0005，未配对t检验），P15和P42之间显著增加（p < 0.005，未配对t检验）。(b条——电子)n个 = 每一发育阶段的幼崽中有3个胰脏，误差为s.e.m(（f）)光学2D截面（5 μm厚；顶行）和相应的3D清晰图像（1000 μm厚，底行）。虽然2D切片足以观察胰岛大小的大体变化，但神经结构（箭头）很稀疏，难以在2D中量化。CLARITY揭示了2D图像无法捕捉到的高分辨率结构，实现了神经重塑动力学的可视化。比例尺 = 100 微米。
图3
图3
整个人体器官的清晰度。(一)CLARITY能够对人类胎儿组织进行高分辨率和高质量的全器官组织处理和分析。可以用胰岛素（Insulin，Ins）和β-微管蛋白（β-tubulin，Tuj1）对101天的胎儿样本（顶行）进行染色，并在不丧失分辨率的情况下通过几毫米的透明组织成像。跨越整个胰腺厚度的四个示例z位置显示了在每个深度观察到的胰岛（箭头）和神经/血管（箭头）。同一组织可以用不同的抗体组多次染色——4型胶原（Col4）和胰高血糖素（Gcg）——（最下面一行），特征分辨率损失最小。比例尺 = 500 μm整个样品，100 μm嵌入。样品嵌入A1B1P4水凝胶中，并在60℃时清除2-3周 摄氏度。60岁时清除5-7天，进行抗体清除 摄氏度。(b条)CLARITY可以自动量化结构特征，包括胰岛大小。在该队列中，91至117天之间，不同发育年龄的平均胰岛大小、人口分布或胰岛大小的空间分布没有显著差异（未配对t检验）。错误：s.e.m.n = 三。
图4
图4
人类发育中的神经内分泌胰腺。(一)CLARITY可以对大型人体组织进行多轮免疫标记，如图1所示 取自3岁人类胰腺的mm厚样本，经两轮染色，检测4型胶原（Col4）、β-微管蛋白（Tuj1）、胰岛素（Ins）、神经丝（NF）和胰高血糖素（Gcg），并使用图像特征一起手动登记。样品嵌入A1B1P4水凝胶中，并在60℃时清除2-3周 摄氏度。比例尺 = 1000 微米。(b条)对3岁和7岁的两个人类胰腺样本进行的3D组织学检查显示了出生后人类发育过程中胰岛大小（虚线）和神经支配（箭头）的差异。比例尺 = 100 微米。(c（c）)胎儿胰岛群分析（n = 3） ，新生儿（n = 3岁、0-3岁）和青少年（n = 3、4-8岁）的人体样本显示，随着年龄的增长，分布向较大的胰岛转移。(d日)对胎儿、新生儿和青少年样本胰岛周围和胰岛内的神经支配的分析表明，在出生后人类发育期间，胰岛附近的神经支配减少。(电子)清晰度可以评估病变组织的相关特征。这里，一名有T1D病史的8岁受试者与健康年龄匹配的对照组相比，显示出极少的胰岛素表达胰岛的证据。样品在相同的条件下进行清洗和染色，但需要进行单独的实验。比例尺 = 500 微米。
图5
图5
全组织三维组织学定量优势的计算机演示。(一)CLARITY支持对大量人群进行自动化分析，从而提供更大的统计置信度。在测量胰岛半径的模拟实验中，从3个P6胰岛和3个P15胰岛CLARITY数据集中随机选择N个胰岛进行替换，并比较胰岛半径平均值。达到统计显著性的实验比较比例（p < 0.05，未配对t检验），当实验进行100次时，绘制出每个实验测量的胰岛数量。当对每个胰腺中大约250个胰岛的大小进行取样时，即使存在真正的趋势，数据也只有50%的可能性是显著的。(b条)大量人口大大减少了实验间的变异性。条形图显示了当测量胰岛大小和神经嵴相互作用的模拟重复100次时，N个胰岛的平均值的范围。随着每次实验的样本量增加，实验范围的宽度以及实验间的可变性都会减小。(c（c）,d日)与二维分析相比，CLARITY提供了更准确的胰岛大小测量。使用CLARITY或8个非相邻的40 μm光学截面，绘制胰岛半径的原始值。功能少于10 μm因小于胰岛（红色）而被排除在分析之外。假负值代表了剩余胰岛的22%（紫色），即当3D大小足够分析时，二维半径估计会错误地排除胰岛。假阳性值表示2%的胰岛（绿色）在3D中被排除，但在2D分析中进行了测量，只有32%的胰岛在2D中估计的大小在3D大小的10%以内。其余（68%）的测量值被低估了10%以上。(电子——克)CLARITY可以更准确地测量胰岛数量。同一样本的2D和3D分析显示胰岛明显过剩 < 切片50μm，但胰岛计数不足 > 50 微米。（n） = 3) (小时)CLARITY可以消除因分段而产生的测量误差。对于每个胰岛，计算2D和3D大小。与体积分析相比，由于二维切片远离胰岛赤道最大值，因此大大低估了胰岛的平均大小。(我)为了评估二维切片厚度对胰岛半径测量的影响，对不同切片厚度的模拟光学切片进行了分析。与3D测量结果相比，所有2D截面都大大低估了胰岛半径。(j个)通过计算值之间的差异并除以3D中的大小，计算出2D和3D中胰岛大小的低估值。基于2D切片的方法低估了近40%的胰岛大小。(k个)为了探讨是否可以通过仅检查大型结构来克服误差，将每个清晰和二维截面中最大的20个胰岛（如果发现小于20个，则为总胰岛）进行平均并比较大小。此外，在每个节段中手动独立和盲选并测量20个胰岛。2D组织学系统地低估了最大胰岛的胰岛半径>20%（p < 0.0001，Mann-Whitney试验）。显示了4个单独的2D截面，以说明切片的尺寸变化。
图6
图6
清晰性在不同生物系统中的应用。(一)清除野生型E10.5小鼠胚胎，并用Tuj1和层粘连蛋白标记。规模：500 微米。(b条)对Wnt1-Cre x Rosa26/TdTomato小鼠的E12.5胚胎进行了澄清和成像，证明了内源性标记的稳健保存。刻度：100μm. (c（c）)对整个E14.5小鼠胚胎进行Tuj1和层粘连蛋白染色，去除抗体标签，并用相同抗体保存标本。规模：1000 微米。(d日,电子)即使经过两轮染色，同样的精细结构特征（箭头）也可以很容易地在整个样品中识别出来（绿色方框）。规模：200 微米。(（f）)CLARITY可以成功清除脱钙的骨骼（请参阅方法）。规模：1000 微米。将面板a-f中的样品嵌入A1B1P4水凝胶中，并在37 °C（参见组织依赖性计时的方法和详细协议）。(克——k个)其他全身器官也可以清除，包括胃肠道（这里，幽门括约肌，刻度：500 μm），肺（刻度：500 μm），心脏（刻度：1000 μm）、肾脏（刻度：100μm）和骨骼肌（刻度：50 微米）。CLARITY保留了精细结构，例如，可以可视化神经肌肉接头（箭头）。面板中的样本(克——k个)来自成人Wnt1-Cre；Rosa26-mT/mG报告线，嵌入A4B4P0水凝胶中，37℃澄清1-2周 °C（参见组织特定时间的详细方案）。
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