Aspartate β-hydroxylase disrupts mitochondrial DNA stability and function in hepatocellular carcinoma

doi:10.1038/oncsis.2017.64

.2017年7月17日；6（7）：e362。

doi:10.1038/oncsis.2017.64。

天冬氨酸β-羟化酶干扰肝细胞癌线粒体DNA稳定性和功能

C唐^1 2, Y Hou先生¹, H王¹, K Wang（K王）¹, H向¹, X万^三, Y夏¹, J李¹, W Wei（魏伟）¹, S Xu先生¹, Z雷¹, T M帕夫利克⁴, H王⁵, M Wu先生¹, F沈¹

附属公司

¹第二军医大学东方肝胆外科医院肝外科，上海，中国。
²第三军医大学大坪医院肝胆外科，重庆，中国。
^三第二军医大学东方肝胆外科医院临床数据库部，上海，中国。
⁴俄亥俄州立大学外科，韦克斯纳医学中心，美国俄亥俄州哥伦布市。
⁵第二军医大学国家肝癌科学中心，中国上海。

PMID： 28714949
预防性维修识别码：项目经理5541716
内政部： 10.1038/oncsis.2017.64

天冬氨酸β-羟化酶干扰肝细胞癌线粒体DNA稳定性和功能

C唐等。肿瘤发生. 2017.

.2017年7月17日；6（7）：e362。

doi:10.1038/oncsis.2017.64。

作者

C唐^1 2, Y Hou先生¹, H王¹, K Wang（K王）¹, H向¹, X万^三, Y夏¹, J李¹, W Wei（魏伟）¹, S Xu先生¹, Z雷¹, T M Pawlik公司⁴, H王⁵, M Wu先生¹, F沈¹

附属公司

¹第二军医大学东方肝胆外科医院肝外科，上海，中国。
²第三军医大学大坪医院肝胆外科，重庆，中国。
^三中国上海，第二军医大学东方肝胆外科医院临床数据库科。
⁴俄亥俄州立大学外科，韦克斯纳医学中心，俄亥俄州哥伦布，美国。
⁵第二军医大学国家肝癌科学中心，中国上海。

PMID： 28714949
预防性维修识别码：项目经理5541716
内政部： 10.1038/oncsis.2017.64

摘要

肝细胞癌（HCC）线粒体基因组异常及其功能的机制目前尚不清楚。我们之前的研究表明，肝癌组织中天冬氨酸β-羟化酶（ASPH）的表达增加，这与肿瘤侵袭性和预后较差有关。目前，我们意外地在纯化的线粒体蛋白组分中观察到ASPH的存在。此外，外源性和内源性表达的ASPH的免疫染色显示与线粒体生物标记物共定位。本研究旨在探讨线粒体ASPH是否参与HCC线粒体功能障碍。我们的结果表明，肝癌组织中ASPH过度表达与置换环（D-loop）和NADH脱氢酶亚基1（ND-1）拷贝数减少以及D-loop突变增强有关，表明线粒体DNA（mtDNA）稳定性受到破坏。mtDNA拷贝数减少与HCC侵袭性临床病理特征相关。ASPH的强制表达导致线粒体DNA完整性的丧失伴随着线粒体功能障碍，其特征是线粒体膜电位异常、ATP生成减少和活性氧增加。相反，siRNA敲低肝癌细胞株中的ASPH对线粒体DNA的完整性和功能有相反的影响。质谱和免疫共沉淀进一步证实ASPH与组蛋白H2A成员X（H2AX）相互作用。ASPH过表达减少了H2AX和线粒体转录因子A（mtTFA）之间的相互作用，mtTFA是线粒体DNA复制的重要DNA结合蛋白，从而减少了mtTFA与D-loop区域的结合。总之，我们的结果表明，ASPH过表达通过H2AX-mtTFA信号破坏线粒体DNA的完整性，从而影响HCC中的线粒体功能。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
ASPH定位于肝癌细胞线粒体。(一)用抗ASPH抗体和线粒体标记物MitoTracker对MHCC-97内源性ASPH免疫染色进行染色 L和EHBC-512细胞。绿色：ASPH蛋白染色；红色：线粒体细胞器染色。采用共聚焦荧光显微镜在×600倍放大下拍摄图像，用于油浸。(b条)用抗GFP抗体和MitoTracker对HepG2和Huh-7细胞中外源性表达的绿色荧光蛋白（GFP）融合ASPH免疫染色进行染色。图像是如上所述拍摄的。(**c（c）**)免疫印迹法检测MHCC-97线粒体和细胞质中内源性ASPH的存在 L和EHBC-512细胞。(d日)免疫印迹法检测HepG2和Huh-7细胞线粒体和细胞质部分存在外源表达的GFP融合ASPH。对于b条和d日，mito：线粒体蛋白的分数；细胞质：细胞质蛋白质的一部分。热休克蛋白60（HSP60）和电压依赖性阴离子通道（VDAC）是线粒体细胞器的生物标志物。Calnexin是内质网的生物标志物。

图2
ASPH表达水平影响肝癌组织中mtDNA的稳定性。(一,b条)从肿瘤和匹配的非肿瘤组织中提取的mtDNA中ND-1和D-loop相对拷贝数的方框图(n个=71），通过实时PCR检测并归一化为β-肌动蛋白DNA的数量。(**c（c）**)基于Sanger测序确定的D-loop区域单核苷酸变异量的肿瘤和非肿瘤组织亚群百分比。在相应的栏中标记每个亚组的患者人数。(d日,电子)实时聚合酶链反应（real-time PCR）检测高肝癌患者亚组中肿瘤ND-1和D-loop拷贝数与匹配非肿瘤组织的比率(n个=34）或低(n个=37）ASPH表达。(**（f）**)Sanger测序检测的肝癌患者线粒体DNA D环区有或无体细胞突变的患者数量(n个=34）或低(n个=37）ASPH表达。对于所有方框图，方框内的条带为平均值，胡须末端代表所有数据的2.5-97.5个百分点的最小值和最大值***P（P）*<0.01, **P（P）*与非肿瘤组织组或ASPH高表达组相比，<0.05。

图3
ASPH表达水平影响肝癌细胞株mtDNA的稳定性。(一)与对照细胞相比，ASPH过表达的HepG2和Huh-7细胞的mtDNA中相对ND-1（左）和D-环（右）拷贝数的改变。(b条)MHCC-97线粒体DNA中相对ND-1（左）和D-loop（右）拷贝数的改变与对照细胞相比，具有沉默ASPH的L和EHBC-512细胞。对于一和b条，mtDNA拷贝数通过实时PCR检测并归一化为β-肌动蛋白DNA的数量。(**c（c）**)根据D-loop区域单核苷酸变异量，用ASPH或对照载体过度表达的HepG2和Huh-7细胞亚克隆的百分比。(d日)MHCC-97亚克隆的百分比根据D-loop区域的单核苷酸变异量，用ASPH siRNA或对照载体过度表达的L和EHBC-512细胞。对于**c（c）**和d日，通过Sanger测序鉴定D-loop突变，并在相应的列中标记各组中的亚克隆数。所有数据均显示为至少三个独立实验的平均值±标准差**P（P）*<0.05, ***P（P）*与矢量组相比<0.01。vec、ASPH和siASPH表明细胞株分别过度表达载体、ASPH及ASPH-siRNA。

图4
ASPH调节HCC细胞系的线粒体功能。(一,b条)用MitoTracker Red染色检测线粒体活性，并用流式细胞仪检测用ASPH和对照载体或MHCC-97过度表达的HepG2和Huh-7细胞中的线粒体活性用ASPH siRNA和对照载体过度表达的L和EHBC-512细胞。荧光计数曲线下面积（AUC）用于定量。(**c（c）**,d日)用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）染色检测线粒体膜电位，并用流式细胞仪检测用ASPH和对照载体或MHCC-97过度表达的HepG2和Huh-7细胞用ASPH siRNA和对照载体过度表达的L和EHBC-512细胞。AUC用于量化。(电子,**（f）**)通过商业生物发光试验检测ASPH和对照载体（MHCC-97）过度表达的HepG2和Huh-7细胞中的细胞内ATP浓度 L和EHBC-512细胞用ASPH siRNA和对照载体过表达。相对发光单位（RLU）用于定量。所有数据均显示为至少三个独立实验的平均值±标准差***P（P）*<0.01, **P（P）*与载体组相比，<0.05。vec、ASPH和siASPH表明细胞株分别过度表达载体、ASPH及ASPH-siRNA。

图5
ASPH调节HCC细胞株中ROS的生成。(一,b条)通过细胞内H2O2浓度表征和分析细胞内ROS生成，并通过流式细胞仪检测用ASPH和对照载体或MHCC-97过度表达的HepG2和Huh-7细胞中的ROS生成用ASPH siRNA和对照载体过度表达L和EHBC-512细胞。(**c（c）**,d日)实时PCR检测ASPH或MHCC-97过表达HepG2和Huh-7细胞中与ROS生成和螯合相关的多个基因的mRNA表达水平比率将沉默ASPH的L细胞和EHBC-512细胞分配给对照组。所有数据均显示为至少三个独立实验的平均值±标准差***P（P）*<0.01, **P（P）*与载体组相比，<0.05。vec、ASPH和siASPH表明细胞株分别过度表达载体、ASPH及ASPH-siRNA。

图6
在肝癌细胞系中，ASPH与mtTFA竞争与H2AX的相互作用。(一)用HA抗体或myc抗体免疫沉淀法检测293细胞中外源表达的HA标记的ASPH和myc标记的H2AX之间的相互作用。(b条)MHCC-97中内源性ASPH与H2AX的相互作用用ASPH抗体或H2AX抗体免疫沉淀法检测L细胞。(**c（c）**)ASPH过度表达对mTFA–H2AX相互作用的影响。用ASPH、POLG和mTFA抗体通过免疫印迹法进一步分析用ASPH过度表达的HepG2细胞和对照载体中H2AX抗体免疫沉淀的蛋白复合物。(d日)通过染色体免疫沉淀（ChIP）-PCR分析鉴定D环区中mTFA结合mtDNA基序。mTFA抗体免疫沉淀MHCC-97中的蛋白-DNA复合物 L细胞。使用覆盖D-loop区域的八对引物进一步扩增假定的结合mtDNA基序，这些引物指定为P1到P8。引物集4（P4）的扩增子在蛋白质-DNA基序中富集***P（P）*与IgG组相比<0.01。(电子)通过ChIP-PCR分析，ASPH过度表达对mTFA与D-loop区域结合概率的影响。在ASPH或MHCC-97过度表达的HepG2细胞中，分析mTFA-DNA复合体中以P4扩增子为特征的D-loop区域的数量与载体过度表达的对照组相比，ASPH沉默的L细胞。所有数据均显示为至少三个独立实验的平均值±标准差***P（P）*与载体组相比<0.01。

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1. Moudgil V，Redhu D，Dhanda S，Singh J.黄曲霉毒素和乙型和丙型肝炎病毒发展肝细胞癌的分子机制综述。《环境病理毒理学杂志》2013年；32: 165–175.-公共医学
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1. Marra M、Sordelli IM、Lombardi A、Lamberti M、Tarantino L、Giudice A等。肝细胞癌的分子靶点和氧化应激生物标记物：综述。运输医学杂志2011；9: 171–184.-项目管理咨询公司-公共医学

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