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.2017年7月24日；27（14）：2123-2136.e7。
doi:10.1016/j.cub.2017.06.021。 Epub 2017年7月14日。

中心卫星控制GABARAP泛滥成灾和GABARAP介导的自噬

贾斯汀·约阿希姆 1, 米努·拉齐 1, 德尔芬·朱迪思 1, 玛蒂娜·沃思 1, 艾米丽·卡拉米塔 1, 维塞拉·恩切娃 2, 布莱恩·戴恩拉赫特 三, 安布罗西斯·斯奈德斯 2, 尼古拉·奥莱利 4, 哈罗德·B·J·杰弗里斯 1, 莎伦·A·图兹 5
附属机构

中心卫星控制GABARAP的泛化和GABARAP-介导的自噬

贾斯汀·约阿希姆等。 当前生物. .

摘要

自噬通过将自噬体捕获的细胞溶质物质传递到溶酶体进行降解，从而在应激期间维持细胞健康和体内平衡。自噬体的形成是复杂的：由自噬（Atg）蛋白向形成位点的募集启动，由Atg蛋白的激活维持，以允许自噬小体的生长和闭合。Atg蛋白如何转位到形成的自噬体尚不完全清楚。ATG8家族成员GABARAP从中心体的转运发生在饥饿诱导的自噬体生物发生过程中，但中心体蛋白如何调节GABARAP定位尚不清楚。我们发现中心粒卫星蛋白PCM1调节GABARAP向中心粒周围物质的募集。除了存在于心周物质上外，GABARAP还标志着PCM1阳性心周卫星的一种亚型。GABARAP，而不是另一个ATG8家族成员LC3B，通过典型的LIR基序直接与PCM1结合。PCM1的缺失通过蛋白酶体降解导致GABARAP的失稳，而不是LC3B的失稳。GABARAP不稳定性通过中心极卫星E3连接酶Mib1介导，Mib1通过其底物结合区与GABARAP相互作用，并促进GABARAP-K48连锁泛素化。GABARAP的泛素化发生在N末端，这是一个在自噬体形成期间与ATG8-家族特异性功能相关的结构域，位于LC3家族中缺失的残基上。此外，PCM1-GABARAP阳性中心粒卫星与形成自噬体共定位。PCM1增强GABARAP/WIPI2/p62阳性自噬体的形成和通量，但对LC3B阳性自噬体的形成没有显著影响。这些数据表明了中心星如何特异性调节ATG8直向同源物、中心体GABARAP库和中心体自噬体串扰的机制。

关键词：ATG8；GABARAP；LIR；Mib1；PCM1；自噬体；自噬；向心卫星；中心体；无处不在。

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数字

无
图形摘要
图1
图1
PCM1通过HEK293A细胞的LIR Motif（a）抗-GABARAP免疫沉淀和免疫印迹直接结合GABARAP。珠+抗体，含蛋白G珠的抗GABARAP抗体；珠+赖氨酸，HEK293A裂解物与蛋白G珠。（B） HEK293A细胞在完全培养基（FM）或EBSS（ES）中培养2小时后进行裂解，然后进行（A）中的处理。（C） 在裂解和GFP-TRAP前2小时，HEK293A细胞在FM、ES或EBSS+BAFA（EB）中表达指示结构。GFP-GABA、GFP-GABARAP；WT，野生型。（D） （C）的统计分析；单向方差分析。NS，无显著性。（E） 表达所示GFP-ATG8结构和免疫印迹的HEK293A细胞的GFP-TRAP。（F） 表达所示GFP标记结构的HEK293A细胞，用GST或GST-GABARAP珠培养并免疫印迹。3xAla，LIR突变体。（G） （F）的统计分析；未配对学生t检验；平均值±SEM；n=3。∗∗∗∗p≤0.0001。（H） 用GST-GABARAP和免疫印迹孵育的覆盖LIR基序的PCM1肽24 mer阵列。每个氨基酸位置都被其他氨基酸所取代。
图2
图2
PCM1和GABARAP在中心体和外周CSs（A）HEK293A细胞在EBSS中饥饿2小时，用小鼠抗PCM1、兔抗GABARAP和山羊抗γ-微管蛋白抗体固定并标记。比例尺代表（顶部）5μm和（底部）2μm。箭头和插图显示PCM1-GABARAP共定位。*PCM处的GABARAP-PCM1。Nuc，细胞核。（B） HEK293A细胞在EBSS中饥饿2小时，用指示的抗体固定并标记。Pearson相关系数（PCC）是在有和没有PCM1 siRNA的情况下，在非中心体GABARAP-PCM1或GABARAP-p62点之间定量的。亚细胞区域是从两个独立的实验中定量的。（C） 表达myc-GABARAP的HEK293A细胞在EBSS中饥饿2小时，然后用兔抗PCM1、小鼠抗myc和山羊抗SSX2IP抗体固定和标记；比例尺，2μm。（D） HEK293 Flp-In T-Rex细胞稳定表达诱导型GFP-GABARAP，在EBSS中饥饿2小时，用兔抗中心蛋白抗体固定并标记。比例尺代表2μm。在（C）和（D）中，箭头表示GABARAP与CS标记的共定位。另请参见图S1和S2。
图3
图3
在自噬体形成（A）HEK293A细胞中发现CSs，稳定表达GFP-WIPI2b，在EBSS中饥饿2小时，用小鼠抗PCM1和兔抗GABARAP抗体固定和标记。比例尺代表5μm。箭头表示三重共定位；箭头表示GABARAP-PCM1双同位化。（B） HEK293A细胞或稳定表达GFP-DFCP1的MEF细胞在EBSS中饥饿2小时，用指示的抗体固定和标记。比例尺代表5μm。箭头表示PCM1和自噬标记物之间的共定位或接触点（GFP-DFCP1）。合并图中的Hoechst DNA染色显示为蓝色。在所有面板中，使用了兔抗PCM1抗体；在其余面板中使用小鼠抗WIPI2或LC3B和豚鼠抗p62抗体。（C） 稳定表达GFP-DFCP1的HEK293细胞在EBSS中饥饿2小时，然后用对照免疫球蛋白G（IgG）或抗GFP进行免疫隔离，并用所示抗体进行免疫印迹分析。另请参见图S2。
图4
图4
PCM1控制PCM、CS和GABARAP自噬体形成（A）HEK293A细胞的GABARAP定位，用无RISC（RF）或PCM1 siRNA处理72小时，固定，并用小鼠抗PCM1、兔抗GABARA和山羊抗γ-微管蛋白抗体标记。比例尺代表20μm。（B） 量化（A）。对近心点物质（γ-微管蛋白阳性结构）的信号强度进行量化并归一化为RF。每个测量值代表一个中心体。利用Mann-Whitney检验进行统计分析；平均值±SEM；来自三个独立实验的数据。∗∗∗∗p≤0.0001。（C） 表达GFP-PCM1 WT或3xAla LIR突变体的HEK293A细胞在EBSS中饥饿2小时，固定，并用兔抗GABARAP和鼠抗WIPI2抗体标记。比例尺表示2μm。箭头，三重同位化；箭头，GABARAP-WIPI2协同定位。*PCM处的PCM1和GABARAP。（D） 表达GFP-PCM1的HEK293A细胞用50μM诺卡唑处理5小时，在EBSS中饥饿2小时，然后用兔抗GABARAP和鼠抗GM130抗体固定和标记。箭头，GFP-PCM1-GABARAP共定位；箭头，GM130-GABARAP共定位。*PCM处的GABARAP。比例尺代表2μm。（E） HEK293A细胞用RF或PCM1 siRNA处理72小时，然后在ES或ES中用巴非霉素A1（EB）孵育2小时，固定并用指示的抗体标记，然后进行共焦显微镜检查和细胞内斑点定量。非配对Student t检验的统计分析；平均值±SEM；*p≤0.05。独立实验数量：WIPI2，3个；GABARAP，5个；第62页，三页；和LC3，两个。（F） 用RF或PCM1 siRNA处理HEK293A细胞72小时，然后在EBSS中孵育2小时，并在共焦显微镜下固定，然后对细胞内GABARAP-p62双阳性点进行量化。平均值±SEM两个独立实验。（G） 表达所示结构的HEK293A细胞在ES或EB中孵育2小时，固定并标记所示抗体，然后共焦显微镜观察和细胞内斑点定量。非配对Student t检验的统计分析；平均值±SEM；∗∗p≤0.01。三个独立实验。参见图S3和S4。
图5
图5
PCM1通过其LIR基序（A）HEK293A细胞特异性调节GABARAP蛋白水平，该细胞经RF或PCM1 siRNA处理，在含有或不含BAFA的全培养基（FM）或EBSS中培养2小时。（B） （A）中的量化。对于LC3-II/actin，n=3。对于p62/actin，n=5。对于NBR1/actin，n=5。对于PCM1/actin，n=5。平均值±SEM。单向方差分析；*p≤0.05。（C和D）用RF或PCM1 siRNA处理的HEK293A细胞，在含有或不含BAFA1的FM或EBSS中培养2小时。在（C）中，GABARAP-I和GABARAP-II被溶解，而在（D）中，只有GABARAP-I在western blot中被溶解。（E） （C）和（D）中的数量。对于GABARAP-II/肌动蛋白，n=5。对于GABARAP-I/actin，n=3。平均值±SEM。单向方差分析；*p≤0.05。（F） 表达所示结构的HEK293A细胞进行免疫印迹。（G） 量化（F）。对于p62/actin，n=4。对于GABARAP-I/actin，n=5。平均值±SEM；未配对学生t检验；∗∗p≤0.01。（H） 用RF或PCM1 siRNA处理HEK293A细胞（总共72小时），并用指定的抗siPCM1构建物转染（最后24小时），然后进行免疫印迹。（一） （H）中的量化。对于RF+GFP、siPCM1+GFP和siPCM1+GFP-PCM1 WT，显示了六个实验。对于siPCM1+GFP-PCM1 3xAla，显示了三个实验。平均值±SEM；未配对学生t检验；∗∗p≤0.01。
图6
图6
PCM1调节GABARAP蛋白酶体降解（A）。在免疫印迹前，对照或PCM1敲除的RPE-1细胞接受指定小时数的环己酰亚胺（CHX）处理。（B） 量化（A）。平均值±SEM；n=3；未配对学生t检验；*p≤0.05。（C） 用RF或PCM1 siRNA处理的HEK293A细胞在DMSO、环己酰亚胺（CHX）、MG132（MG）和/或巴非霉素A1（BAFA1）中培养8小时。（D） （C）的量化。平均值±SEM；n=3；单因素方差分析；*p≤0.05。
图7
图7
免疫印迹分析Mib1 E3连接酶与GABARAP相互作用并使其失稳，促进Lys13和Lys23（A）HEK293A细胞表达FLAG-Mib1或对照载体的GABARAP泛素化48小时。（B） 量化（A）。非配对Student t检验的统计分析；平均值±SEM；n＝3；*p≤0.001。（C） 免疫印迹法分析HEK293A细胞中的抗-GABARAP免疫沉淀物。抗体，抗GABARAP抗体。赖氨酸，HEK293A裂解物。（D） 表达FLAG标记构建物的HEK293A细胞与重组GST或GST-GABARAP珠培养并进行免疫印迹。（E） 表达所示结构和免疫印迹的HEK293A细胞的GFP-TRAP。免疫沉淀物在变性缓冲液中严格洗涤。CS、C985S；GAB、GABARAP；Ponc，Ponceau S.显示了短曝光和长曝光。*,∗∗,***分别为单、双和三种泛素化GFP-GABARAP。（F） 表达所示结构的U2OS细胞的免疫沉淀在煮沸的SDS缓冲液和免疫印迹中溶解。游离泛素和*,∗∗,***，分别指示了单泛素化、二泛素化和三泛素化的GFP-LC3B/GABARAP。（G） 表达所示结构和免疫印迹的HEK293A细胞的GFP-TRAP。免疫沉淀物按（E）所示进行清洗。（H） 参见（G）。显示了低曝光和高曝光。（一） 表达所示结构和免疫印迹的HEK293A细胞的免疫沉淀。在TNTE缓冲液（20 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，0.5%w/v Triton X-100，5 mM EDTA）+N-乙基马来酰亚胺中裂解之前，用MG132处理细胞5小时。双泛素化GABARAP表示为∗∗免疫球蛋白轻链用箭头表示。（J） 用RF或GABARAP siRNA处理HEK293A细胞72小时后进行免疫沉淀，并表达指示的结构和免疫印迹。细胞在TNTE缓冲液+N-乙基马来酰亚胺中裂解前用MG132处理5小时。二元和三元GABARAP表示为∗∗和***分别为。免疫球蛋白轻链用箭头表示。（K） 通过质谱法在三种不同肽上鉴定了两个GABARAP泛素化位点，赖氨酸13（K13）和赖氨酸23（K23）。（顶部）显示了含有K13泛素化位点的FVYKEEHPFEK（diGly）R肽的峰面积比较（n=3个测量值）。（中部和底部）K23泛素化位点被检测为两种不同的肽，这是因为缺失了切割。定量肽K（diGly）KYPDRVPVIVEK（中间）和K（diGly）KUPDR（底部）显示，C985S突变体的丰度显著低于WT（L）。GABARAP K13和K23的保守性(*)ATG8正交曲线之间。另请参见图S5。
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