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.2017年7月12日；8(1):69.
doi:10.1038/s41467-017-00057-x。

体内NOX2氧化酶加剧病毒致病性，是抗病毒治疗的靶点

Eunice E收件人 1 2, 罗斯·弗拉霍斯 1, 雷蒙德·良（Raymond Luong） 2, 米歇尔·哈尔斯 3, 帕特里克·C·雷丁 4, 保罗·T·金 5, 克里斯托弗·陈 2 6, 格兰特·德拉蒙德 7, 克里斯托弗·索比 7, 布拉德·R·S·布劳顿 2, 马尔科姆·R·斯塔基 8, 蕾妮·范德斯鲁伊斯（Renee van der Sluis） 9, 沙龙·R·勒温 9 10, 史蒂文·博兹诺夫斯基 1, 卢克·A·J·奥尼尔 11, 蒂姆·奎奇 12 13 14, 克里斯托弗·波特 12 14, 道格·布鲁克斯 15, 约翰·奥利里 16 17 18, 斯塔夫罗斯·塞莱米迪斯 19 20
附属公司

内体NOX2氧化酶加剧病毒致病性，是抗病毒治疗的靶点

Eunice E收件人等。 国家公社. .

摘要

病毒流行病和流行病的迫在眉睫的威胁要求需要针对病毒病理学的治疗方法，而不考虑感染菌株。活性氧是保护植物、真菌和动物免受包括细菌在内的病原体侵袭的古老过程。然而，在哺乳动物中，活性氧的产生通过尚未定义的机制反常地促进了病毒的致病性。在此，我们发现活性氧的主要酶源NOX2氧化酶被内吞小室中的单链RNA和DNA病毒激活，从而产生胞内过氧化氢，通过修饰独特的，Toll-like受体-7上高度保守的半胱氨酸残基（Cys98）。因此，靶向抑制胞内活性氧生成可消除甲型流感病毒的致病性。我们的结论是，内体活性氧物种促进病毒致病性的基本分子机制，而内体靶向活性氧物种抑制剂对这一致病过程的特异性靶向性对病毒疾病的治疗具有指导意义。活性氧的产生是一种古老的抗菌机制，但其在哺乳动物抗病毒防御中的作用尚不清楚。在这里，To等人表明，病毒感染激活了内体NOX2氧化酶并限制TLR7信号传导，内体NOX2抑制剂降低了病毒的致病性。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1
季节性和大流行性甲型流感病毒通过激活NOX2氧化酶诱导胞内活性氧的产生。一,b条感染甲型流感病毒株HKx31（MOI of 10）的野生型（WT）小鼠原代肺泡巨噬细胞共聚焦显微镜观察1 h，并用早期内体抗原1（EEA1）抗体和任何一种抗体标记一甲型流感病毒核蛋白（NP）或b条NOX2，然后与4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色). 还显示了结果的量化(n个 = 5).c（c）,d日OxyBURST（100 μM）共聚焦荧光显微镜并用DAPI标记(n个 = 5).e（电子）,（f）WT、NOX2内体ROS生成−/年和超氧化物歧化酶（SOD；300 U/ml）处理的WT小鼠原代肺泡巨噬细胞，在不存在或存在HKx31病毒的情况下通过OxyBURST共聚焦荧光显微镜进行评估并用DAPI标记(n个 = 5).克用OxyBURST和酸化内体标记物Lysotracker（50 nM）。用巴非霉素A（Baf-A；100）处理一些细胞 nM）抑制内体酸化(n个 = 4).小时感染季节性H3N2（A/纽约/55/2004，A/布里斯班/9/2007）、季节性H1N1（A/新喀里多尼亚/20/1999，A/所罗门群岛/3/2006）和大流行性A（H1N1）pdm09菌株（A/加利福尼亚/7/2009，A/奥克兰/1/2009）的人肺泡巨噬细胞，并用OxyBURST标记内腔ROS(n个 = 4).我,j个通过OxyBURST荧光显微镜评估暴露于任一热（56 ºC） -灭活HKx-31病毒（阻止病毒融合）或紫外线激活的HKx-31毒（阻止复制）并用DAPI标记(n个 = 4).一–我图像代表了在每次实验中分析的150多个细胞。原始放大倍数×100。一,b条,d日,（f）和j个数据表示为平均值 ± S.E.M.公司。一和b条学生未成对t吨-测试*P（P） < 0.05之间。d日,（f）和j个单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的事后检验（post-hoc test）用于多重比较*P（P） < 0.05和**P（P） < 0.01. 比例尺：10 微米
图2
图2
TLR7与甲型流感病毒、NOX2和EEA1的共定标是通过TLR7和PKC依赖机制使内体ROS生成甲型流感的信号平台。一–c（c）未经治疗或感染甲型流感病毒HKx31（MOI为10）并用TLR7抗体和一甲型流感病毒NP，b条NOX2或c（c）EEA1，然后加入4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）。还显示了来自多个实验的量化数据(n个 = 5).d日WT和TLR7中的体内ROS生成−/−Oxyburst（100）评估小鼠原代肺泡巨噬细胞 μM）荧光显微镜，在没有或存在HKx31病毒的情况下，用DAPI标记(n个 = 6).e（电子）免疫荧光显微镜用于评估NOX2和p47phox相关性。WT和TLR7−/−未经治疗或感染了HKx31病毒（MOI为10）的永生化骨髓源性巨噬细胞（BMDM），但没有或存在巴非霉素A（Baf-A；100） nM）或发电机（Dyna；100 μM），然后用NOX2和p47phox抗体标记。还显示了结果的量化(n个 = 5).（f）,克WT和NOX2内体ROS生成−/年在不存在或存在（f）imiquimod（Imiq；10 μg/ml）和克ssRNA（100 μg/ml），并与DAPI联合标记。(n个 = 5).小时,我WT和TLR7中通过FRET分析评估的胞浆PKC活性−/−BMDM。用溶媒对照或巴非霉素A（100）处理细胞 nM）或发电机（10 μM），然后暴露25 对甲型流感病毒（HKx31，MOI为10）或咪喹莫特（10 μg/ml）(n个 = 3).一–克图像代表了在每次实验中分析的150多个细胞。原始放大倍数×100。所有数据均表示为平均值 ± S.E.M.公司。一,b条,c（c）,（f）和克学生的未婚t吨-测试*P（P） < 0.05之间。d日,e（电子）,小时和我单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的事后检验（post-hoc test）用于多重比较*P（P） < 0.05. 比例尺：10 微米
图3
图3
ssRNA和DNA病毒的体内ROS产生分别通过TLR7和TLR9依赖性机制。一WT和TLR7中的体内ROS生成−/−OxyBURST评估骨髓源性巨噬细胞（100 μM）在不存在或存在甲型流感病毒（HKx31病毒）、鼻病毒（rhino）、呼吸道合胞病毒（RSV）、人类副流感病毒（PIV）、人类偏肺病毒（HMPV）、仙台病毒、登革热病毒、人类免疫缺陷病毒（HIV）、腮腺炎病毒（MuV）、新城疫病毒（NDV）的情况下的荧光显微镜，轮状病毒（英国株和牛株）、单纯疱疹病毒2型（HSV-2）和痘苗病毒，并用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）标记。还显示了结果的量化(n个 = 5).b条WT和TLR9中的体内ROS生成−/−在没有或存在HKx31病毒、鼻病毒、仙台病毒、登革热病毒和单纯疱疹病毒2（HSV-2）并用DAPI标记的情况下，用OxyBURST荧光显微镜评估小鼠初级肺泡巨噬细胞(n个 = 5).一和b条图像代表了在每次实验中分析的150多个细胞。原始放大倍数×100。所有数据均表示为平均值 ± S.E.M.单向方差分析，然后是Dunnett的事后检验，用于多重比较。# P（P） < 与WT对照组相比，0.05*P（P） < 水平条表示0.05比较。比例尺：10 微米
图4
图4
细菌诱导的活性氧生成与病毒依赖的活性氧机制不同。一噬菌体超氧化物生成流感嗜血杆菌和肺炎链球菌经OxyBURST评估（100 μM）WT和TLR7中的荧光显微镜−/−永生化骨髓来源的巨噬细胞。图像代表了在每次实验中分析的150多个细胞。原始放大倍数×100。b条是结果的量化吗(n个 = 5). 所有数据均表示为平均值 ± S.E.M.单向方差分析，然后是Dunnett的事后检验，用于多重比较*P（P） < 与WT对照组相比，0.05。比例尺：10 微米
图5
图5
体内外，NOX2氧化酶通过TLR7激活抑制细胞因子表达。一,b条WT和TLR7−/−永生化骨髓源性巨噬细胞（BMDM）未经治疗或使用咪喹莫特（Imiq；10 μg/ml）一罗布青素（Apo；300 μM）或b条巴非霉素A（Baf-A；100 nM）和24小时后QPCR测定的IFN-β、IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA表达 小时(n个 = 6).c（c）,d日WT和NOX2−/年小鼠服用咪喹莫特（50 μg/小鼠，鼻内）和c（c）通过支气管肺泡灌洗液分析和d日细胞因子表达评估24 小时后(n个 = 5).一,b条,d日响应与GAPDH相关，然后表示为WT控制之上的折叠变化。一–d日数据表示为平均值 ± S.E.M.公司。一,b条和d日Kruskal–Wallis检验与Dunn的post-hoc进行多重比较。c（c）单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的事后检验（post-hoc test）用于多重比较。当P（P） < 0.05. *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01
图6
图6
内体NOX2氧化酶衍生过氧化氢（H2O（运行）2)抑制细胞因子表达以响应TLR7在体内外的激活。一WT小鼠原代肺泡巨噬细胞未经治疗或用FITC-标记的过氧化氢酶治疗5 感染HKx31病毒前分钟（MOI为10）。细胞被标记为Lysotracker（50 nM）和共聚焦显微镜评估Lysotracker和FITC过氧化氢酶的共定位。图像代表了在每次实验中分析的100多个细胞。原始放大倍数×100(n个 = 3） 。b条WT和TLR7−/−永生化骨髓源性巨噬细胞（BMDM）未经治疗或治疗1 h，含过氧化氢酶（1000 U/ml）和24天后QPCR测定的IFN-β和IL-1βmRNA表达 小时(n个 = 7).c（c）WT BMDM未经治疗或治疗1次 h在不存在或存在过氧化氢酶（1000）的情况下，使用咪喹莫特（Imiq） U/ml），IFN-β和IL-1β，mRNA表达评估24 小时后由QPCR(n个 = 6).d日WT BMDM治疗30次 DMSO（0.1%）或dynasore（Dyna；100）中的最小值 μM），然后使用过氧化氢酶（1000 U/ml）用于1 h.24小时后QPCR测定细胞因子mRNA表达 小时(n个 = 6).e（电子）WT和TLR2−/−用过氧化氢酶（1000 U/ml）用于1 24小时后QPCR测定h和细胞因子mRNA表达 小时(n个 = 6).（f）WT和UNCB93−/−用过氧化氢酶（1000）处理永生化BMDM U/ml）用于1 24小时后QPCR测定h和细胞因子mRNA表达 小时(n个 = 6).克–我WT BMDM治疗1次 h与过氧化氢酶或咪喹莫特（10 μg/ml）和克TLR7，小时NLRP3或我24天后QPCR测定TREML4 mRNA表达 小时(n个 = 6).j个小鼠经鼻内注射过氧化氢酶（每只小鼠1000 U），然后通过QPCR测定TREML4在肺部的表达(n个 = 5).k个和我对WT小鼠和k个BALF总气道炎症和我肺细胞因子表达评估24 小时后(n个 = 5).b条–j个和我响应与GAPDH相关，然后表示为WT控制之上的折叠变化。b条–小时和我Kruskal–Wallis检验与Dunn的post-hoc进行多重比较。我和j个Mann–Whitney Wilcoxon试验。所有数据均表示为平均值 ± 当P（P） < 0.05. *P（P） < 0.05. 比例尺：10 微米
图7
图7
TLR7上的C98调节受体的活性，是内体H的靶点2O（运行）2.一TLR7级−/−用空载体WT TLR7或TLR7转染BMDM，转染半胱氨酸98、260、263、270、273和445突变为丙氨酸（TLR7 6 mut），转染TLR7，转染半胱氨酸98和445变异为丙氨酸的TLR7C98A/445 A） 或TLR7与半胱氨酸445（TLR7C445A）或98（TLR7 C98A）突变为丙氨酸。48岁之后 h、 细胞未经处理或处理1 h与过氧化氢酶（1000 U/ml）或咪喹莫特（咪喹，10 μg/ml）和细胞因子表达评估24 小时后(n个 = 6） 。响应与GAPDH相关，然后表示为TLR7以上的折叠变化−/−控制。数据表示为平均值 ± S.E.M.单向方差分析，然后是Dunnett的事后检验，用于多重比较。当P（P） < 0.05之间*P（P） < 0.05. （NS）表示不重要。b条CLUSTAL OMEGA的多序列比对显示TLR7上Cys 98的跨物种保护
图8
图8
抑制NOX2氧化酶可增加I型干扰素和IL-1β的表达，并产生抗甲型流感病毒感染的抗体。一来自WT和Nox2的肺泡巨噬细胞−/年将小鼠置于未经治疗（幼年）或感染了HKx31流感A病毒（MOI为10）的状态，在24小时后通过QPCR分析IFN-β、IL-1β、TNF-α和IL-6 mRNA的表达 小时(n个 = 8).b条,c（c）WT和Nox2−/年小鼠感染了活的HKx31甲型流感病毒（1 × 105每只鼠标的PFU）和b条细胞因子mRNA表达和干扰素β蛋白表达c（c）BALF或d日3天后评估血清(n个 = 5).e（电子）–我WT和Nox2−/年小鼠感染灭活的HKx31甲型流感病毒（相当于1 × 104每只小鼠的PFU），用于第7天的测量：e（电子）体重；（f）气道炎症和差异细胞计数（即巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞）；克全肺细胞因子表达（反应显示为相对于GAPDH的倍数变化）和小时血清和我BALF抗体水平(n个 = 6） 。数据显示为平均值 ± 东南方。一Kruskal–Wallis检验与Dunn的post-hoc进行多重比较。b条–我未付款t吨-测试；当P（P） < 0.05. *P（P） < 0.05. **P（P） < 0.01
图9
图9
体内靶向传递NOX2氧化酶抑制剂可保护甲型流感病毒感染后的小鼠。一–e（电子）用Cy5胆固醇-PEG连接物荧光团（Cy5-chol；100）处理WT小鼠的肺泡巨噬细胞 nM）30 分钟，感染了HKx31甲型流感病毒（MOI为10）。然后用抗体对细胞进行反标记，以：一和b条EEA1、，c（c）NOX2或d日流感A核蛋白（NP）。然后用4′，6′-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对所有细胞进行染色，并用共焦显微镜进行成像。b条用dynasore（100）预处理细胞 μM）30 在暴露于Cy5胆甾烷醇之前的分钟。e（电子）数据的量化(一–d日,n个 = 5).（f）RAW 264.7巨噬细胞未经处理或用不同浓度的胆固醇结合gp91ds-TAT（Cgp91）、乙基结合gp91ds-TAT（Egp91）或非结合gp91ds-TAT（Ugp91）处理30个月 在定量L-O12产生ROS之前的分钟（100 μM）增强化学发光(n个 = 7).克在没有或存在Ugp91ds-TAT的情况下，通过黄嘌呤/黄嘌呤-氧化酶无细胞分析产生超氧化物，（1 μM）或Cgp91ds-TAT（1 微米）(n个 = 6).小时,我Ugp91ds-TAT（0.02 mg/kg/天）或Cgp91ds-TAT（0.02 mg/kg/天），每天一次，连续4天。24点 第一次给药抑制剂后h，用生理盐水或感染HKx31甲型流感病毒（1 × 105每只鼠标的PFU）。在感染后第3天扑杀小鼠小时通过BALF细胞计数和我QPCR测定肺IFN-βmRNA(n个 = 7). （NS）表示不显著。j个–米小鼠接受NOX2抑制剂治疗方案和病毒感染方案，如小时NOX2抑制剂的剂量为0.2除外 毫克/千克/天(n个 = 7). 分析j个通过BALF计数的气道炎症，k个体重（与第1天测量值相比的重量变化百分比），我L-O12增强化学发光和米QPCR检测病毒mRNA。数据表示为平均值 ± S.E.M.公司。e（电子）未付款t吨-测试；当P（P） < 0.05之间。（f）,克,小时,j个,k个,我单因素方差分析（ANOVA）和Dunnett的事后检验（post-hoc test）用于多重比较。我和米Kruskal–Wallis检验与Dunn的post-hoc进行多重比较。当P（P） < 0.05. *P（P） < 0.05; **P（P） < 0.01. 比例尺：10 微米
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