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.2017年8月7日；214(8):2271-2282.
doi:10.1084/jem.20161715。 Epub 2017年7月11日。

靶向Notch3信号的治疗性抗体预防CADASIL中的壁细胞丢失

阿图罗·马库卡·帕拉 1, 亚历山大A Bigger Allen 1, 安吉·桑切斯 1, 安妮莎·布塔拉 1 2, 乔纳森·卡多纳·韦莱斯 1 三, Dhanesh Amarnani公司 1, 马加里·圣杰尼兹 1, 克里斯蒂安·西贝尔 4, 利奥·A·金 1, 帕特里夏·A·达摩 5 6, 约瑟夫·F·阿博莱达·维拉斯克斯（Joseph F Arboleda-Velasquez） 7
附属公司

靶向Notch3信号的治疗性抗体预防CADASIL中的壁细胞丢失

阿图罗·马库卡·帕拉等。 实验医学杂志. .

摘要

伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病（CADASIL）是一种以小血管疾病（SVD）、中风、血管认知障碍和痴呆为特征的神经系统综合征，由槽口3目前还没有治疗这种情况的方法。包括周细胞和血管平滑肌细胞在内的壁细胞的缺失是CADASIL和其他SVD的标志，包括糖尿病视网膜病变，导致血管不稳定。在这里，我们表明，Notch3信号传导对于使用Notch3基因敲除小鼠的基因救援支持动脉壁细胞覆盖是必要的，也是充分的。此外，我们还表明，全身注射激动剂Notch3抗体可防止壁细胞丢失，并修饰与Notch3活性相关的血浆蛋白，包括C455R突变小鼠的内皮抑素/胶原18α1和Notch3胞外结构域，这是一种与Notch2功能丧失相关的CADASIL变体。这些发现为通过调节Notch3信号治疗CADASIL和其他SVD开辟了机会。

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数字

图1。
图1。
人类Notch3拯救N3KO小鼠的壁画细胞丢失。（A） 用于研究Notch3信号遗传救援的四种小鼠菌株的示意图：WT Notch3（N3WT，白色）、Notch3基因敲除（N3KO，浅灰色）、条件性表达WT人类Notch3的小鼠（hN3WC，深灰色）和条件性表示人类CADASIL突变体Notch3小鼠（C455R，黑色）。（B） 视网膜整体支架的代表性免疫荧光图像显示SMA染色为红色和白色，ColIV为绿色（左侧；条形图，2.5 mm）。红色虚线矩形（左侧）表示右侧显示的区域（条形，250µm）。（C） 视网膜主动脉和分支动脉SMA覆盖率的量化。n个=每组5。*，P<0.05；**，P<0.01；通过方差分析进行统计分析。图表中的值表示为平均值±SEM。结果代表了两个独立的实验。TEM获得的大脑皮层左半球视网膜血管（D；bar，20µm）和脑血管（E）的超微结构图像，在角（bar，20μm）处切割。图中显示了内脏（Lu）、血管内皮细胞（EC）、基底膜（BM）、壁细胞（MC）、MC间隙（黑色箭头）和凋亡小体（白色箭头）。类似地，视网膜（F）和大脑（G；条形图，1μm）的每幅图像都突出显示了相同的六个特征。N3WT小鼠表现出接触或密切相关的大块状MC，而N3KO和C455R小鼠表现出大间隙和细长的MC。hN3WT展示了相互并列的细长MC。（D–G）图像代表了针对每个基因型分析的三只小鼠。N3KO、C455R和hN3WT是窝友。N3WT小鼠在室内单独饲养。（B、D和E）将追踪血管的图像缝合在一起，以生成完整的图像。
图2。
图2。
人类Notch3拯救N3KO和CADASIL小鼠的血管渗漏。（A） 所列基因型的小鼠视网膜荧光素血管造影图像：N3WT、N3KO、hN3GT、C455R，以及作为杂合子（C455R/hN3WD）条件性表达hN3G和C455R的小鼠。箭头表示泄漏事件（bar，300μm）。（B） 图中显示了N3WT中泄漏事件的量化(n个=6），N3KO(n个=6），hN3WT(n个=5），C455R(n个=3）和C455R/hN3WT(n个=5）小鼠。图中的数值表示为平均值±SEM*，P<0.05。数据通过方差分析进行分析。N3KO、C455R、hN3WT和C455R/hN3WT.是同窝动物。N3WT小鼠在室内单独饲养。（A和B）结果代表了两个独立的实验。
图3。
图3。
A13-Notch3激动剂抗体在体外通过C455R突变激活配体不敏感的Notch3受体。（A） 示意图显示Notch3受体的结构和A13抗体与NRR结构域相互作用的结合位点。图中显示了Lin12-Notch（LNR）、异二聚体结构域（HD）和跨膜结构域（TM）。在用A13或对照IgG抗体治疗后，对表达Notch3 WT受体（B）或Notch3 C455R（C）的HEK 293细胞进行单细胞培养中Notch信号的荧光素酶报告分析。TET表示用于诱导转基因表达的四环素浓度。HEK 293细胞共培养中Notch信号的荧光素酶报告分析。表达Notch3 WT或C455R Notch3受体的HEK 293细胞与对照细胞（D）或表达Jagged 1（E）的HEK 29.3细胞共同培养。表达Notch3 WT的HEK 293细胞与对照细胞（F）或用IgG或A13抗体处理的表达Jagged 1（G）的细胞共同培养。表达Notch3 C455R的HEK 293细胞与对照细胞（H）共同培养，或与用IgG或A13处理的表达Jagged 1（I）的细胞共同培养。ELISA测量每个培养物的细胞培养上清液中的N3ECD，Notch3 WT（J）和C455R（K）。在化合物E（L）存在下表达Notch3 WT受体的HEK 293细胞的单细胞培养中进行Notch信号的荧光素酶报告分析。在存在化合物E（M）的情况下，ELISA测定细胞培养上清液中的N3ECD。荧光素酶报告法检测用增加浓度的A13（N）处理的表达Notch3 WT受体的HEK细胞的单一培养物中的Notch信号。ELISA测定用增加浓度的A13（O）处理的细胞培养上清液中的N3ECD。通过基因报告分析测定的Notch3信号激活与ELISA测定的细胞培养上清液中N3ECD水平增加相关（P）。（B–P）*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。数据通过方差分析进行分析。图表中的值表示为平均值±SEM。结果代表三个独立实验，每个实验包括每个条件的三个技术复制。
图4。
图4。
A13-Notch3激动剂抗体可防止CADASIL小鼠的壁细胞丢失。（A） 在N3KO（浅灰色）和CADASIL突变小鼠（黑色）中注射A13抗体的时间线。（B，左）用IgG或A13抗体处理的N3KO和C455R突变小鼠的视网膜整体支架的代表性免疫荧光图像显示绿色SMA染色。（右）绿色和白色信号的合并图像（CollV染色；条形，100µm）。箭头显示每个基因型的SMA覆盖的小血管。追踪血管的图像被缝合在一起以生成完整的图像。（C） N3KO视网膜血管SMA覆盖率的量化（IgG治疗，n个= 5; A13处理，n个＝4）和C455R（IgG处理，n个= 11; A13处理后，n个=6）来自10轮独立的注射。每个数据点代表单个鼠标的值。水平线表示平均值±SEM*，P<0.05。数据通过方差分析进行分析。C455R和N3KO小鼠是窝友。（D） 注射A13或IgG抗体并用V1662抗体染色的C455R脑组织图像。C455R IgG(n个=3）和C455R A13(n个= 3). 棒材，100µm。结果代表了两个独立的实验。
图5。
图5。
A13 Notch3激动剂抗体逆转CADASIL小鼠N3ECD和内皮抑素/胶原18α1中的血浆生物标志物变化。点图显示用A13治疗的6周龄C455R小鼠的N3ECD（A）、内皮抑素/胶原18α1（B）、IGFBP-1（C）和HTRA1（D）的血浆水平(n个=10）或IgG(n个=8）来自10轮独立注射的抗体。（A-D）**，P<0.01。通过未配对的双尾Student’s进行统计分析t吨测试。每个数据点代表单个鼠标的值。水平线显示平均值±SEM。C455R小鼠为窝友。
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