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.2017年7月11日6:e23202。
doi:10.7554/eLife.23202。

间充质祖细胞中Tsc2的破坏导致肿瘤血管异常过度表达拉加尔3

附属公司

间充质祖细胞中Tsc2的破坏导致肿瘤血管异常过度表达拉加尔3

彼得·克洛弗等。 埃利夫. .

摘要

来自的mTORC1信号增加TSC1/TSC2在癌症中发现失活,并导致结节性硬化综合征(TSC)。通过破坏TSC肿瘤发生过程中间质来源细胞的功能,研究了其在TSC肿瘤形成中的作用Tsc2型颅面和四肢芽间充质祖细胞。Tsc2cKO公司Prrx1克小鼠寿命缩短,前肢出现大量错构瘤,其中包含异常扭曲、扩张的血管。mTORC1抑制剂西罗莫司可阻断异常。Tsc2缺陷的成纤维细胞中发现的Tsc2/mTORC1表达特征在膀胱癌患者中也增加TSC1类/TSC2系统TCGA数据库中的突变。签名组件拉加尔3Tsc2缺陷细胞和Tsc2cKO血清中编码galectin-3增加优先级x1-cre小鼠。半乳糖凝集素-3在与TSC相关的皮肤肿瘤、血管平滑肌脂肪瘤和淋巴管平滑肌瘤病中增加,淋巴管平滑肌瘤病患者的血清水平与肺功能受损和存在血管平滑肌瘤相关。我们的研究结果表明,Tsc2缺陷的间充质祖细胞会引起异常的形态发生信号,并鉴定出包括拉加尔3与人类疾病相关TSC1/TSC2失活和mTORC1过度活动。

关键词:肿瘤生物学;半乳糖凝集素-3;人;人类生物学;mTORC1;药物;小鼠;结节性硬化综合征。

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数字

图1。
图1.Tsc2cKO的特性Prrx1-芯老鼠。
(A类)无(左2只幼崽)或表达EYFP荧光的新生儿体内成像Prrx1-芯(右2只小狗)。在牛奶中的胃中观察到荧光。(B类)新生儿皮肤成纤维细胞的基因型Prrx1-芯表达小鼠(左侧面板)和新生儿表皮(右侧面板)。标签代表从尾部DNA观察到的基因型,不表达Prrx1-芯或包含重组(Tsc2型-)等位基因。(C类)Tsc2cKO腹侧皮肤或四肢新生皮肤成纤维细胞蛋白质的Western blotPrrx1-芯(KO)或Tsc2型飞行/飞行对照组(WT)用指示的抗体进行探测。10多个细胞系也有类似结果。(D类)培养的表达EYFP的新生儿肢体皮肤成纤维细胞的流式细胞术。约95%的细胞表达EYFP。(E类)与对照组相比,Tsc2cKO小鼠的皮肤组织学显示真皮厚度和细胞数更大。比例尺,0.1 mm。2-5个月龄的对照组和Tsc2cKO小鼠(对照组:=9、Tsc2cKO n=7)。数据表示为平均值±标准偏差,**p<0.001。(F类)采用Kaplan-Meier生存分析确定Tsc2cKO小鼠的中位生存率。Tsc2cKO与对照组不同(p<0.001,log-rank检验)。在Tsc2cKO小鼠中,雄性的中位生存期为28周,雌性为24周,但这种差异不显著(p=0.392,对数-秩检验)。控件n=28人(全部28人均被审查),M Tsc2cKO n=22(8次审查),F Tsc2cKO n=24(9次审查)。此图的源数据如图1所示:源数据1、2和3。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.003
图1-图补充1。
图1——补充图1:Tsc2cKO的面部和骨骼表型Prrx1-芯(cKO)小鼠。
(A类)cKO小鼠的面部异常包括球状鼻子和加厚的眼睑。(B类)胡须垫皮肤的组织学显示细胞、血管和胶原蛋白增加。比例尺,0.1 mm(C类)WT和cKO小鼠的CT图像显示四肢和颅骨的骨骼异常。(D类)Tsc2cKO的颅骨厚度增加了3倍以上Prrx1-芯老鼠。通过从4-6个月大的成年WT(n=4)和cKO小鼠(n=8)颅骨中心附近的类似横截面MRI图像中推断颅骨空间来测量颅骨厚度,**p<0.001。(E类)WT和Tsc2cKO的X射线Prrx1-芯小鼠表现出更短、更厚的骨骼和更大的骨量(F类)WT和Tsc2cKO的H&EPrrx1-芯这表明,骨获取量的增加大大增加了骨直径,缩小了骨髓间隙。比例尺,0.1 mm。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.007
图2。
图2.Tsc2cKO的大体和组织病理学Prrx1-芯小鼠(Tsc2cKO)。
(A类)成年Tsc2cKO的前爪生长。(B类)12周对照组和连续成像Tsc2cKO小鼠的全身MRI 2D图像。在上胸部/肩部检测到高信号强度(粉红色箭头)。其他异常见于肾脏(小囊肿,绿色箭头)和脾脏(肿大和不规则图案,蓝色箭头)。(C类)4至5个月大的对照组(上面板)和成年Tsc2cKO小鼠(下面板)的肾脏和肝脏的大体外观显示出典型的肿瘤。(D类)4至5个月大的对照组(上面板)和成年Tsc2cKO小鼠(下面板)脾脏和肩部区域的大体外观。(E类)Tsc2cKO小鼠肩部和腋窝区的组织学外观。(E))错构瘤区,血管异常,脂肪丰富。(E)ii(ii))异常大的血管,血管壁厚且纤维化,内皮发育不良。(E))脂肪瘤区含有脂肪样细胞,其嗜酸性胞浆不断增加。(E)iv(四))淋巴结附近淋巴发育不良。免疫组织化学研究,包括抗GFP(F、 G公司)抗CD31(H、 我),抗α-平滑肌肌动蛋白(SMA)(J、 K(K))和抗HMB-45(五十、 M(M))Tsc2cKO小鼠前肢错构瘤(F、 H、J、L)和对照小鼠的前肢血管(G、 I、K、M). 对照组和Tsc2cKO组织的IHC染色在来自至少n=4只小鼠的切片中是一致的。比例尺:E为0.5 mm;E为0.05 mm,E为0.025 mmii(ii)-E类iv(四)、G和K;F、H、I J、L和M为0.05 mm。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.008
图2——图补充1。
图2-图补充1。肾脏和肝脏肿瘤的IHC。
A-D:Tsc2cKO中的肝脏和肾脏肿瘤Prrx1-芯小鼠的组织学外观与Tsc1型-Tsc2型-单倍体小鼠。(A类)4个月Tsc2cKO的H&E染色Prrx1-芯肾显示肾小管上皮中发育有囊腺瘤。(B类)抗-GFP染色显示EYFP表达Tsc2型肾囊肿上皮中的KO细胞。(C类)Tsc2cKO小鼠肝脏肿瘤的H&E染色显示血管通道充满血液。(D类)抗-GFP染色显示EYFP表达Tsc2型肿瘤区有KO细胞,但肝细胞没有。A-D的比例尺:0.15 mm。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.009
图2——图补充2。
图2补充图2 Tsc2cKO的MRI血管造影Prrx1-芯老鼠。
(A–D)利用最大信号强度投影重建图像生成矢状面血管造影图。(A类)WT前部(B类)Tsc2cKO公司Prrx1-芯与WT相比,前部显示头部和前腿区域有许多迂曲的血管(C类)WT后部区域。(D类)Tsc2cKO公司Prrx1-芯后部有许多曲折的血管。E-F:上胸部横切面。(E类)WT上胸和上肢。(F类)Tsc2cKO公司Prrx1-芯上胸部血管结构异常,包括上肢和颅骨区域的大量紊乱血管。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.010
图2——补充图3。
图2补充图3。胸腔外腋窝肿块液体的甘油三酯和胆固醇分析。
照片显示在血清分离管中离心前后的液体与混浊的液体混合物。与配对血清样本(分别为136、74和167 mg/dL)相比,3/3小鼠的液体样本的甘油三酯水平较高(408、230和1726 mg/dL。血清正常=41-258 mg/dL。与血清胆固醇水平(119、117和170 mg/dL)相比,这三只小鼠液体中的胆固醇水平在三分之三的小鼠(90、90和95 mg/d L)中较低。与配对血清样本相比,高甘油三酯水平表明乳糜在体液中起作用。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.011
图2——图补充4。
图2-图补充4:人体和小鼠血管的弹性蛋白染色。
(A类)LAM患者肾脏的正常血管(左),箭头指示弹性纤维。同一肾脏AML区的发育不良血管(右),箭头显示细而破碎的弹性纤维。比例尺,0.100 mm(B类)WT小鼠(左)的血管带有典型的染色弹性纤维(箭头所示)。TSc2cKO肩部肿瘤Prrx1-芯带有发育不良血管的小鼠(右),箭头表示弹性纤维细而破碎。使用从Rowley Biochemical,Inc.(#F-379)购买的试剂,用Hart的方法对弹性蛋白进行染色。比例尺,0.050 mm。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.012
图2——补充图5。
图2—补充图5。Tsc2cKO的上肢淋巴错构瘤Prrx1-芯老鼠。
(A类)H&E显示纵向前肢包含一个发育异常和囊性腋窝淋巴结,作为淋巴错构瘤的一部分。棒材,1 mm(B–E类)“A”中所示区域的序列段。比例尺,0.050 mm(B类)淋巴结增生异常区域,包含纤维化和薄而扩张的血管,血管内皮细胞呈圆形。(C类)淋巴结异常淋巴管内淋巴标志物LYVE1的表达。(D类)淋巴结异常淋巴管内淋巴标志物VEGFR3的表达。(E类)抗-GFP染色检测EYFP表达显示EYFP-在Tsc2cKO腋窝淋巴结中的内皮表达。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.013
图2——图补充6。
图2-补充图6。Tsc2cKO前爪和脾脏肿瘤的组织学。
(A类)前爪H&E染色显示掌侧广泛错构瘤。比例尺,0.250 mm.(A). 从图2中,图补充1A插图。比例尺,0.05 mm(B类)前爪肿瘤EYFP表达的抗-GFP免疫染色。比例尺,0.05 mm(C类)抗-GFP染色显示EYFP阳性对照小鼠前爪的血管。比例尺,0.025毫米(D类)cKO前爪错构瘤α-SMA染色。比例尺,0.05 mm(E类)cKO前爪错构瘤CD31染色。(F类)脾错构瘤结节的H&E染色。比例尺,0.250 mm.(F):从图2中,图补充1F插图。比例尺,0.05 mm(G公司)脾错构瘤的抗-GFP。比例尺,0.05 mm(H(H))EYFP阳性对照小鼠脾血管的抗-GFP。比例尺,0.025 mm()脾肿瘤抗α-SMA染色。比例尺,0.05 mm(J型)抗CD31染色。比例尺,0.05 mm。内政部: 网址:http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.014
图3。
图3.Tsc2cKO错构瘤Prrx1-芯(Tsc2cKO)小鼠含有间充质和内皮KO细胞,对西罗莫司敏感。
(A类)3-引物PCR检测Tsc2型-Tsc2型佛罗里达州Tsc2型+使用基因分型引物在新生儿器官(上图)和成人肿瘤组织中检测等位基因(下图)。在三只单独的新生和成年Tsc2cKO小鼠中也发现了类似的结果。(B类)复制的编号Tsc2型与从WT细胞中分离的DNA相比,从富含FACS的EYFP表达脾细胞中分离出的DNA中第3外显子减少。Tsc2型外显子6和Tsc1型拷贝数分析作为对照进行(YFP+脾脏肿瘤中n=3)。(C类)cKO小鼠EYFP阳性培养脾细胞中CD90.2的表达证实了脾脏肿瘤中含有Tsc2缺陷细胞的Tsc2缺乏间充质成分。在其他两个cKO脾脏中观察到类似结果。(D类)分离和培养的前爪肿瘤的流式细胞术证实,这些肿瘤含有Tsc2缺陷CD31-阳性细胞。上部:YFP阴性的Tsc2cKO前爪肿瘤细胞。中间:YFP阳性的Tsc2cKO前爪肿瘤细胞。较低:从对照前爪分离并培养表达EYFP的细胞。E、 F:西罗莫司缩小肿瘤大小。从出生后第25天开始每隔一天向Tsc2cKO小鼠注射西罗莫司(5 mg/kg)或溶媒,持续30天。然后每周用卡尺测量前爪厚度,并在第30天处死小鼠。(E类)用载体(左)或西罗莫司(右)治疗30天的前爪组织切片。(F类)治疗期间测量的cKO前爪厚度(第24天*p=0.03,第30天*p<0.001)。G、 H:西罗莫司使皮肤厚度部分正常化。(G公司)西罗莫司30天后的皮肤组织学图像。比例尺,0.1 mm(H(H))在服用30天西罗莫司(载药n)后测量皮肤厚度=8,西罗莫司n=10只小鼠,*p=0.003). F和H的误差线表示±S.D。此图的源数据如图3所示。源数据1-3。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.017
图4。
图4小鼠新生皮肤成纤维细胞的转录组学分析确定了Tsc2依赖性和mTORC1依赖性特征基因,包括LGALS3型,其mRNA在患有TSC1类TSC2系统突变。
(A类)n=3(每个样本代表不同幼崽的一个新生儿)WT的差异调节基因的热图,Tsc2型−/−+车辆,以及Tsc2型−/+西罗莫司处理的小鼠新生皮肤成纤维细胞的FDR小于10%。基因集中于野生型车辆的中位数Tsc2型−/−v(v)汽车. (B类)基于统计上表现过度的基因本体类别(p<0.001),从Tsc2依赖型和mTORC1依赖型特征基因中选择的基因的热图,包括缺氧反应、细胞死亡调节、细胞周期调节和糖酵解过程。(C类)11个基因在Tsc2型−/−并且通过与GO类别“细胞外区域”和“信号传导”相匹配的西罗莫司治疗而降低。(D类)拉加尔3以WT表示,Tsc2型−/−+车辆,以及Tsc2型−/−+西罗莫司处理皮肤成纤维细胞。(E类)鼠标Tsc2-依赖性基因表达特征在两种非沉默突变的人膀胱癌中增加TSC1类TSC2系统(n=43)与含有WT的肿瘤相比TSC1类TSC2系统基因(n=348,p=0.005)。(F类)LGALS3型mRNA在非静止突变的人膀胱癌中表达升高TSC1型TSC2、,p=0.015。箱线图水平线标记第25、50和75个百分位,胡须延伸至最远点,小于或等于四分位间距的1.5倍。此图的源数据如图4所示:源数据1、2、3、4和5。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.022
图5。
图5 Tsc2cKO中Gal-3的生成和分泌增加Prrx1-芯小鼠(cKO),部分受mTORC1控制。
(A类)对照组和cKO前肢组织的Gal-3免疫染色。cKO小鼠的错构瘤在血管和血管周细胞内显示Gal-3阳性染色。(B类)对照和cKO小鼠前爪真皮的Gal-3免疫染色。(C类)未经处理或用20nM西罗莫司处理48小时的新生儿WT和KO真皮成纤维细胞的蛋白质印迹。用Tsc2、Gal-3和肌动蛋白抗体探测印迹。(D类)按指示处理的WT和KO新生儿皮肤成纤维细胞48小时培养上清液中的Gal-3分泌。Gal-3水平通过小鼠ELISA测定(n=每组3个细胞系)*p<0.05。(E类)显著增加(p=0.004)成人Tsc2cKO血清Gal-3水平Prrx1-芯观察小鼠(11只)与对照小鼠(15只)的比较。(F类)8周龄、30天的西罗莫司治疗小鼠(n=8只)的血清显示显著(p=0.04)与对照组(n=6只小鼠)相比,Gal-3减少。D-F的误差条表示A和B中的±S.D.比例尺为0.1 mm。此图的源数据如图5所示,源数据1、2。内政部: 网址:http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.028
图6。
图6肾TSC皮肤肿瘤、LAM结节和AML中Gal-3的表达。
(A类)TSC患者正常皮肤活检的Gal-3免疫染色。(B类)Gal-3在TSC甲周纤维瘤皮肤肿瘤中的表达。(C类)TSC皮肤肿瘤成纤维细胞培养上清液中的Gal-3水平。耳部皮肤外观正常(NL)n=11例;血管纤维瘤=7名患者,p=0.020对NL;甲周纤维瘤=5名患者,p=0.028 vs.荷兰;纤维状头部斑块(FCP)n=3名患者,p=0.026 vs.NL。对于一些患者,多个皮肤肿瘤细胞系的Gal-3水平是平均值。(D类)Western blot显示TSC2和Gal-3水平的相关性。显示了四名代表性患者的成对皮肤样本。NL=培养的正常皮肤成纤维细胞和T=TSC皮肤肿瘤成纤维细胞。(E类)Gal-3在LAM结节中的表达代表4例受试LAM患者样本。面板左下方的气道上皮也呈阳性。(F类)Gal-3在血管平滑肌脂肪瘤(AML)病变中的表达代表n=3例AML患者样本。(G公司)在已证实LAM且未服用mTOR抑制剂的患者中,%FEV1与Gal-3血清水平显著负相关(r=-0.32,p=0.010,n=64,每个人仅使用一个样本进行分析)。N=无TSC(零星LAM)。Y=TSC-LAM。 (H(H))伴有和不伴有AML的LAM患者Gal-3水平的比较。对于轻度LAM患者(%FEV1>80),AML患者的Gal-3水平(n=33)高于无AML患者(n=25)*第页=0.045. %FEV1<80的患者,Gal-3水平与AML状态无显著差异。对于所有面板,*表示p<0.05。误差线表示A、B、E和F中的±S.D.比例尺为0.05 mm。此图的源数据如图6所示,源数据1、2和3。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.031
图6——图补充1。
图6-图补充1.半乳糖凝集素-3在LAM结节肿瘤细胞以及肺上皮中的表达。
LAM结节的连续切片如a-D所示(A类)LAM结节的H&E。(B类)高倍镜下的抗-Gal-3(C类)抗αSMA显示平滑肌LAM细胞阳性。(D类)抗-HMB45呈LAM结节散在阳性染色特征。比例尺:A-D=0.025 mm。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.035
图6——图补充2。
图6-图补充2.半乳糖凝集素-3表达AML肿瘤细胞以及正常肾脏。
肾脏AML的连续切片如a-D所示(A类)反洗钱健康与环境。(B类)高倍镜下的抗-Gal-3。(C类)抗αSMA显示平滑肌AML细胞阳性。(D类)抗-HMB45呈AML结节散在阳性染色特征。比例尺:A-D=0.025 mm。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.036
图6——图补充3。
图6补充图3。在已证实服用mTOR抑制剂的LAM患者中,%FEV1与Gal-3血清水平无相关性。
接受mTOR抑制剂治疗的患者的Gal-3血清水平与%FEV1成正比。数据显示,对于服用mTOR抑制剂的LAM患者(n=72),未发现Gal-3与%FEV1相关(R(右)=0.066,p=0.580)。内政部: http://dx.doi.org/10.7554/eLife.23202.037

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引用人

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