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.2017年7月10日；7(1):4942.
doi:10.1038/s41598-017-05232-0。

线粒体分裂和融合的多态性调控改变神经炎症中小胶质细胞的表型

加藤光彦 1, 鲍武 1 2, Huy Bang Nguyen先生 1, Truc Quynh泰语 1, 山崎隆夫 三, 卢海燕 三, 安娜·M·里奇 三, 穆萨布·M·佐鲁 三, 新崎友一 4, 尤里卡·赛托 1, Sei Saitoh先生 1, 佐藤隆志 1, 池田和弘 5, 小泉舒一郎 4, 理查德·兰索霍夫 三, 大野信彦 6 7
附属公司

线粒体分裂和融合的多态性调控改变神经炎症中小胶质细胞的表型

加藤光彦等。 科学代表. .

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，在包括髓鞘原发性疾病在内的疾病环境中发挥着复杂的作用。尽管线粒体对神经系统的细胞功能和生存至关重要，但对线粒体动力学和小胶质细胞相关信号的改变及其作用仍知之甚少。在本研究中，通过结合免疫组织化学和3D超微结构分析，我们发现反应性小胶质细胞中的线粒体分裂/融合与髓鞘疾病模型中单核细胞源性巨噬细胞和正常白质分支小胶质细胞的线粒体裂变/融合受到不同调节。小鼠脑小胶质细胞体外实验表明，脂多糖刺激TLR4可引起线粒体裂变蛋白、动力相关蛋白1（Drp1）的活化，并增强活性氧（ROS）的产生，广泛用于检测小胶质细胞反应。活性氧水平的增加激活了5'腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK），并促进了线粒体沿着微管轨道的伸长。这些结果表明，在炎症条件下，反应性小胶质细胞线粒体分裂和融合的多态性调控是由不同的信号转导的，并通过ROS的产生调节小胶质细胞的表型。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
实验性自身免疫性脑脊髓炎发病时脊髓组织中长线粒体和小胶质细胞源性巨噬细胞的圆形核。(一)固定和切片（i）后，用DAB（ii）对脑组织进行免疫染色，并将其嵌入树脂中(一，iii）。采集序列图像进行3D重建(一，iv）。RFP-细胞核（上面板）和原始免疫电镜图像（中、下面板）的重建(b条，红色）和GFP-(c（c），绿色）脊髓中的阳性细胞抄送2 射频脉冲/+::Cx3cr1型 绿色荧光粉/+带有DAB存款的鼠标(b、 c，星号）。DAB阴性细胞的细胞核（中央）和免疫对照细胞（右侧）也显示出来。分级(d日)和计数(e（电子）,如果)RFP阳性的单核细胞源性巨噬细胞（MDM）和GFP阳性的小胶质细胞源巨噬细胞（MiDM）的核形状。单个图像(g、 小时)和核能(i、 j)和线粒体(k、 我)MDM的三维重建(g、 k，我，红色）和MiDM(h、 j、l，绿色）。显示线粒体(克,小时，箭头）。长线粒体和短线粒体分别呈蓝色和品红色(k、 我). 线粒体长度(米)和体积(n个)对MiDM和MDM进行了比较。ns：不显著***第页 < 0.001英寸U型-测试。N个 = MDM或MiDM中线粒体为648或786。棒材：2μm。
图2
图2
从过度表达蛋白脂质蛋白（PLP）的小鼠获得的脱髓鞘小脑白质中，变形虫样小胶质细胞中的线粒体主要为较短和较小的线粒体。5个月龄野生型（WT，a、 b条)和PLP过度表达（PLPtg，c–f)老鼠。免疫控制部分也显示出来(e、 （f）). 在免疫电子显微镜（EM）中，用DAB沉积Iba1(g、 小时，箭头），用矩形指示的区域(克)被放大了(小时). 单电子显微照片(i、 j)和细胞核的三维重建(k、 我)和线粒体(m、 n个)WT小脑白质中的Iba1阳性细胞(i、 千米)和PLPtg(j、 l、n)显示小鼠和线粒体长度(o个)和体积(第页)进行了统计比较。长线粒体和短线粒体分别呈蓝色和洋红色(米,n个)***第页 < 0.001英寸U型-测试。N个 = WT或PLPtg小胶质细胞线粒体为68或506。棒材：50μm(a、 c、e)，20微米(b、 d、f)，2.5微米(g–j).
图3
图3
脂多糖（LPS）刺激诱导原代小胶质细胞培养中线粒体的断裂和随后的延长。(一)将小胶质细胞的原代培养物与LPS一起或不与LPS一起孵育2、6和12小时，然后对小胶质细胞标记物（Iba1）、线粒体外膜（OMM和TOM20）和线粒体内膜（IMM和COX I）进行免疫细胞化学染色（ICC）。Iba1（b1-4）、TOM20（c1-4）和COX I（d1-4）免疫荧光的代表性图像，圆形度（与细胞面积/周长成比例）(e（电子）)，线粒体长度测量为TOM20-(c（c），箭头，如果)和COX I阳性(d日，箭头，克)显示了配置文件。续：非模拟培养物****第页 < 0.0001英寸U型-测试。N（续，2小时、6小时、12小时） = （130、120、128、113）个单元(e（电子）)线粒体(如果)和（1135、1704、1280、1348）线粒体(克). 显示了中位数（条形）和四分位范围（方框）(e–g). 棒材：50μm(b条)，20微米(c、 d日).
图4
图4
用脂多糖（LPS）刺激培养的小胶质细胞后，电子显微镜三维重建显示线粒体断裂和随后的延伸，以及网络恢复。有或无LPS刺激的培养小胶质细胞(一，i）固定并嵌入树脂中，用SBF-SEM成像(一线粒体从序列图像中重建(一，iii）。典型嵴线粒体(b条，黄色）进行重建和着色(c、 d日)培养的小胶质细胞未受LPS刺激（对照，c（c）)LPS刺激后2小时(d日，LPS 2小时）。长度测量(e（电子）)和分支编号(如果)如图所示。长线粒体和短线粒体分别呈蓝色和粉红色(c、 d日)***第页 < 0.001英寸U型-测试。棒材：5μm。
图5
图5
脂多糖（LPS）刺激后线粒体沿着微管的延伸。实验方案表明，原代小胶质细胞培养物被快速冷冻（QF）、冷冻取代（FS），并对α-微管蛋白和线粒体内膜（IMM）标记物COX I进行免疫染色(一). 未经LPS刺激的小胶质细胞线粒体（COX I）和微管（α-微管蛋白）的双重免疫染色(b条箭头所示）或LPS刺激后12小时(c（c），箭头）。插图中显示了用矩形（b3、c3、d3）表示的区域。沿直线（b3、c3、d3）测量荧光强度，箭头显示相同位置（b4、c4）的α-微管蛋白（品红色）和COX I（绿色）的强荧光强度。棒材：30μm。
图6
图6
脂多糖（LPS）诱导的小胶质细胞线粒体断裂受Drp1信号控制，并引起线粒体活性氧（ROS）的产生。原代小胶质细胞培养物在不含LPS（Cont）或含LPS的情况下培养2（2hr）、6（6hr）和12（12hr），然后进行Western blotting分析，以检测Ser616磷酸化激活的总Drp1和Drp1（p-Drp1）或MitoSOX分析，以测测线粒体ROS(一). LPS刺激原代小胶质细胞培养2小时，包括或不包括Drp1抑制剂（Mdivi-1）或N-乙酰半胱氨酸抑制剂（NAC），并进行免疫染色或MitoSOX分析(一). LPS刺激后磷酸化Drp1和总Drp1的蛋白质印迹。(b条). 代表性图片(c、 d日)和测量长度(e（电子）)TOM20-免疫阳性线粒体图谱显示。N个 = 2672（续）、5040（载体）和2820（Mdivi-1）线粒体(e（电子）). 未经LPS刺激的原代小胶质细胞培养的MitoSOX图像（续，如果)或LPS刺激2（2hr，克)，6（6小时，小时)或12（12小时，我)显示并量化hr(j个). N个 = 287（对照组）、444（LPS 2hr）、318（LPS 6hr）和309（LPS 12hr）细胞。每个点代表每个单元格。代表性图片(k、 我)和平均荧光强度(米)LPS刺激2小时后小胶质细胞培养物中的线粒体SOX(我)或不带(k个)Mdivi-1治疗。N个 = 336（续）、306（车辆）和N = 297（Mdivi-1）细胞。代表性图片(n–p)并测量线粒体长度(第页)2小时后(n、 第页)或12小时(o、 q个)LPS刺激Toll样受体4（TLR4）(p、 q个)或不带(n、 o（o）)NAC治疗。N个 = （r）中的173（续）、570（2小时载体）、411（12小时载体）、572（2小时NAC）和364（12小时NAC）线粒体***第页 < 0.001，****磅 < 0.0001和n.s.：在U型-测试。中间带(e、 j、m、p，bar），四分位范围(e、 第页，盒子；j个,米，胡须）。棒材：20μm(c、 d日,n-平方)，50微米(f–i型,k、 我).
图7
图7
活性氧激活5′-单磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）以促进线粒体伸长。(一)用或不使用过氧化氢（H2O（运行）2)以及选择性AMPK抑制剂化合物C（Comp C），然后进行Western blotting（WB）和免疫染色（ICC）。经H处理的Thr172磷酸化AMPK（p-AMPK）的Western blotting2O（运行）2和组件C(b条，左），以及Western blotting分析的量化(b条，右侧）*第页 < t检验为0.05（N = 6） 。每个点代表每个复制，并显示平均值（条）。代表性图片(c–f)和测量的长度(克)TOM20-免疫阳性线粒体图谱与H2O（运行）2和组件C.N = 1975（控制），4536（H2O（运行）22小时），3156（高2O（运行）212小时），3486（高2O（运行）22小时 + 组件C）和2966（H2O（运行）212小时 + Comp C）（线粒体），未注明：不显著，****p < 0.0001英寸U型-测试。中间带(克，条），具有四分位数范围(克，方框）。棒材：20μm。
图8
图8
脂多糖（LPS）刺激12小时后的线粒体伸长是由活性氧（ROS）和活化的AMP活化蛋白激酶（AMPK）介导的。原代小胶质细胞培养物未经处理（Cont）或用LPS处理2（2小时）或12（12小时）小时，使用或不使用包括ROS清除剂（N-乙酰半胱氨酸；NAC）和化合物C（Comp C）在内的药物，然后进行蛋白质印迹和TOM20免疫染色(一). LPS刺激后在Thr172磷酸化的AMPK（p-AMPK）和总AMPK的蛋白质印迹(b条). 经或不经NAC处理的p-AMPK的蛋白质印迹(c（c）（左）和western blotting分析的量化(c（c），右侧）*第页 < 0.05，**p < t检验0.01（N = 6） 。每个点代表每个复制，并显示平均值（条）。代表性图片(d–g)和测量的长度(小时)TOM20-免疫阳性线粒体图谱中NAC治疗与否(小时). 模型的图形摘要如下所示(我). N个 = 1818（对照），3489（LPS 2hr），2238（LPS 12hr），（LPS 2 hr + 组件C）和3654（LPS 12小时 + Comp C）线粒体(小时). ****第页 < 0.0001英寸U型-测试。中间带(小时，bar），四分位范围(小时，方框）。棒材：20μm。
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