Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis

doi:10.1038/s41598-017-05078-6

.2017年7月7日；7(1):4897.

doi:10.1038/s41598-017-05078-6。

层粘连蛋白B1水平调节胚胎皮质发育过程中向神经元的分化

萨米汉·马哈贾尼^1 2, 卡特琳娜·贾科米尼^1 3, 费德里卡·马里纳罗¹, 大卫·德·皮埃特里·托内利¹, 安德里亚可参赛¹, 劳拉·加斯帕里尼^4 5

附属公司

¹意大利热那瓦意大利技术研究所神经科学和脑技术部。
²德国哥廷根瓦尔德威格33号哥廷根医科大学，邮编：37073。
³英国伦敦SE1 1UL盖伊校区纽亨特学院伦敦国王学院癌症研究部。
⁴意大利热那瓦意大利技术研究所神经科学和脑技术部。laura.gasparini@abbvie.com。
⁵Abbvie Deutschland GmbH&Co，德国路德维希港Knollstr，67061。laura.gasparini@abbvie.com。

PMID： 28687747
预防性维修识别码：项目经理5501862
内政部： 10.1038/s41598-017-05078-6

层粘连蛋白B1水平调节胚胎皮质发育过程中向神经元的分化

萨米汉·马哈贾尼等。科学代表. 2017.

.2017年7月7日；7(1):4897.

doi:10.1038/s41598-017-05078-6。

作者

Sameehan Mahajani^1 2, 卡特琳娜·贾科米尼^1 3, 费德里卡·马里纳罗¹, 大卫·德·皮埃特里·托内利¹, 安德里亚可参赛¹, 劳拉·加斯帕里尼^4 5

附属公司

¹意大利热那瓦意大利技术研究所神经科学和脑技术部。
²德国哥廷根瓦尔德威格33号哥廷根医科大学，邮编：37073。
³英国伦敦SE1 1UL盖伊校区纽亨特学院伦敦国王学院癌症研究部。
⁴意大利热那瓦意大利技术研究所神经科学和脑技术部。laura.gasparini@abbvie.com。
⁵Abbvie Deutschland GmbH&Co，德国路德维希港Knollstr，67061。laura.gasparini@abbvie.com。

PMID： 28687747
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内政部： 10.1038/s41598-017-05078-6

摘要

层蛋白B1是核板的关键成分，在大脑发育中起着重要作用。小鼠内源性层粘连蛋白B1（Lmnb1）的消融严重损害胚胎脑发育和皮质生成。然而，这些神经发育影响的机制尚不清楚。在这里，我们报道了拉明B1水平调节小鼠神经干细胞（NSC）分化为神经元和星形胶质细胞样细胞。在体外，内源性Lmnb1缺失有助于NSC在神经元上分化为胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫反应细胞，而人Lamin B1（Lmnb1）的过度表达增加了神经元的比例。在Lmnb1-null胚胎中，神经发生减少，而在小鼠胚胎大脑中，通过子宫内电穿孔特定Lmnb1 sh-RNA，在体内Lmnb1-沉默会导致神经元皮质定位异常，并增加7日龄幼鼠皮质中星形胶质细胞标志物GFAP的表达。总之，这些结果表明，精细调节的拉明B1水平是NSC分化为神经元、星形胶质细胞标志物GFAP的正确表达和皮质激素生成所必需的。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
*最小1*缺乏改变神经干细胞分化为神经元和星形胶质细胞。神经干细胞培养自*最小1* ^+/+和*最小1* ^Δ/Δ胚胎并分化2、4或6天。(A类,B类)βIII微管蛋白免疫反应性的荧光图像(A类；红色）和GFAP(B类；绿色）分化4天的NSC。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺：50 微米。(C类)分化细胞的定量分析。数据表示神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞占细胞总数的百分比*第页 < 0.05，**p < 0.01 vs Lmnb1^+/+在相应的分化时间，即Student t检验。在3个独立的实验中，每个染色条件下大约1000个细胞被量化。(D类–F类)细胞标志物GFAP mRNA表达的定量分析(D类)，βIII-管蛋白(E类)和DCX(F类)在NSC中*最小1* ^+/+和*最小1* ^Δ/Δ处于未分化状态或分化4天后*第页 < 0.05，**p < 0.01，双向方差分析，然后进行Bonferroni事后检验。(**G公司**,**H（H）**)NSC自我更新的定量分析。编号(**G公司**)和直径(**H（H）**)测量了72个神经球接种等量细胞（200个细胞/胚）的单细胞悬浮液后h。(我)中比重核的定量分析*最小1* ^+/+和*最小1* ^Δ/ΔNSC。共计数300个细胞。在所有图表中，条形图表示平均值 ± 来自3个独立实验的SEM。

图2
LMNB1过度表达增加了NSC分化为神经元的比例。将来自C57BL6/J胚胎的NSC转染pEGFP或pLMNB1-EGFP并分化2、4或6天。(A类–D类)βIII-管蛋白免疫反应的荧光图像(A类,B类；红色），GFAP(C类,D类；红色）和EGFP(A类–D类；绿色）分化4天的NSC。细胞核用DAPI（蓝色）复染。比例尺：50 微米。(E类)分化细胞的定量分析。数据表示共表达EGFP的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞占EGFP总数的百分比⁺单元格*第页 < 0.05，**p < 0.01 vs pEGFP转染细胞在各自的分化时间，Student t检验。约400个EGFP⁺在3个独立的实验中对每个染色条件下的细胞进行定量。(F类)NSC固缩核的定量分析。对每种条件下的150个细胞进行计数。在所有图表中，条形图表示平均值 ± 来自3个独立实验的SEM。

图3
Lmnb1缺乏显著损害胚胎发育过程中的皮质生成和神经生成。(A类)大脑切片中皮层厚度的定量分析*最小1* ^+/+和*最小1* ^Δ/ΔE13.5、E15.5和E17.5的胚胎。(B类)E13.5皮质冠状切片的荧光图像*最小1* ^+/+和*最小1* ^Δ/Δ对大脑进行βIII-管蛋白免疫染色（红色），并用Hoechst 33342（蓝色）进行复染。比例尺：20 微米。(C类)E13.5脑内IZ/CP和VZ/SVZ厚度的定量分析**第页 < 0.01 vs Lmnb1各自的脑区^+/+. (D类)E13.5大脑中VZ/SVZ中的细胞计数。(E类)E13.5脑内VZ/SVZ细胞的核区。(F类)E13.5大脑中IZ/CP中的细胞计数。(**G公司**)E13.5脑内IZ/CP细胞的核区。在所有图表中，条形图表示平均值 ± 来自3个独立实验的SEM*第页 < 0.05，**p < 0.01，学生t检验。

图4
敲除Lmnb1增加GFAP蛋白表达体内.分析脑匀浆中GFAP蛋白的表达*最小1* ^Δ/Δ和*最小1* ^+/+Lmnb1沉默后P7 C57BL6/J幼崽的胚胎或脑切片。(A类)GFAP、βIII-管蛋白、Lmnb1和肌动蛋白的Western blot分析。(B类,C类)GFAP定量分析(A类,B类)和βIII-管蛋白(A类,C类)在E17.5中*最小1* ^Δ/Δ和*最小1* ^+/+大脑溶解。数据在MemCode上进行规范化。图形栏表示平均值 ± 扫描电镜（SEM.n） = 3/基因型，*p < 0.05; **第页 < 0.01，学生t检验。裁剪印迹如图4A所示，全长印迹如补充图S5所示。(D类,E类)用sh-Scr电穿孔后P7脑中Lmnb1（红色）和EGFP（绿色）免疫反应性的共焦z堆栈图像的最大投影(D类)和sh-Lmnb1(E类)箭头表示相应的电穿孔细胞。比例尺：5 微米。(F类)用sh-Scr和sh-Lmnb1质粒电穿孔的P7脑中EGFP（绿色）免疫反应的荧光共焦图像。比例尺：50 微米。白线划出VZ/SVZ和皮质表面边界。黄色线条描绘箱子（Hevner等.），由阿拉伯数字标识。罗马数字表示皮质层I-VI.MZ，边缘区；SP，底板。细胞核用Hoechst 33342染料（蓝色）复染；白色星号表示心室。(**G公司**)EGFP的定量分析⁺P7大脑中的细胞与sh-Scr和sh-Lmnb1电穿孔后它们在皮层中的位置有关。图形栏表示EGFP的平均百分比⁺细胞/层 ± 来自3个独立实验的SEM*第页 < 0.05，**p < 0.01 vs sh-Scr中的各层，学生t检验。(**H（H）**)新生P7 C57BL6/J脑中GFAP（红色）免疫反应的荧光共聚焦图像。(我,J型)用sh-Scr电穿孔的P7 C57BL6/J脑中GFAP（红色）和EGFP（绿色）免疫反应共焦z堆叠图像的最大投影(我)或sh-Lmnb1(J型). 在(**H（H）**–J型)，细胞核用Hoechst 33342（蓝色）复染。白色星号表示心室。比例尺：100 微米。(**K（K）**)电穿孔脑内GFAP区域免疫反应的定量分析。GFAP公司⁺面积表示为截面面积的百分比。图形栏表示平均值 ± 扫描电镜，n = 3; *第页 < 0.05，学生t检验。

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[1] Zastrow MS、Flaherty DB、Benian GM、Wilson KL。核TIN在体内外与A型和B型层粘连蛋白相互作用。细胞科学杂志。2006;119:239–249. doi:10.1242/jcs.02728。-内政部-公共医学

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[3] Broers JL等。A型和B型层粘连蛋白在正常人体组织中有差异表达。组织化学。细胞生物学。1997;107:505–517. doi:10.1007/s004180050138。-内政部-公共医学

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[5] Tunnah D、Sewry CA、Vaux D、Schirmer EC、Morris GE。许多组织细胞核中明显缺乏层粘连B1和emerin是由于表位掩蔽。《分子历史杂志》。2005;36:337–344. doi:10.1007/s10735-005-9004-7。-内政部-公共医学

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[7] Worman HJ，Lazaridis I，Georgatos SD。哺乳动物细胞中的核膜异质性。主要层粘连蛋白的差异表达和层粘连B磷酸化的变化。生物学杂志。化学。1988年；263:12135–12141.-公共医学

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[9] 林斯特、傅莹。miR-23对层粘连B1的调节对少突胶质细胞的发育和髓鞘形成至关重要。数字化信息系统。模型。机械。2009;2:178–188. doi:10.1242/dmm.001065。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[10] 林斯特、傅莹。miR-23对层粘连B1的调节对少突胶质细胞的发育和髓鞘形成至关重要。数字化信息系统。模型。机械。2009;2:178–188. doi:10.1242/dmm.001065。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

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