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.2017年7月7日；12（7）：e0180143。
doi:10.1371/journal.pone.0180143。 2017年电子收集。

卡介苗增强肺泡腔胞吐保护宿主抵抗流感肺炎

桑杰·穆克吉 1, Renuka Subramaniam公司 1, 韩晨（Han Chen） 1, 安东尼·史密斯 1, 希瓦·克沙瓦 2, Homayoun Shams公司 1
附属公司

卡介苗增强肺泡腔胞吐保护宿主抵抗流感肺炎

桑杰·穆克吉等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

肺泡吞噬细胞（AP）的胞吐作用在维持肺部稳态中起着关键作用。AP的细胞外化增加可防止肺部感染引起的致命急性肺损伤，而AP的细胞内化缺陷可导致慢性肺部炎症。在本报告中，我们发现卡介苗（BCG）的肺部给药显著增强了AP的胞吐作用。AP增加的胞吐作用维持了肺内稳态，并保护小鼠免受致命的流感肺炎的侵袭。经卡介苗鼻内注射治疗的野生型C57Bl/6（WT）小鼠体内APs胞吐率显著高于经PBS治疗的小鼠。所有BCG处理的WT小鼠在致命的甲型流感病毒（IAV）感染中存活，而所有PBS处理的小鼠死亡。在IAV感染之前，通过消耗AP，卡介苗诱导的耐药性被消除。卡介苗治疗增加了AP对凋亡细胞的摄取和消化/清除。卡介苗显著增加AP上TIM4的表达，并增加Rab5和Rab7的表达。我们证明，通过卡介苗的肺部给药，AP细胞的胞吐增加，启动了凋亡细胞从肺泡腔的快速清除，维持肺内环境稳定，减少炎症，并保护宿主免受致命的IAV肺炎。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益：Homayoun Shams是PlosOne的AE。其他作者宣称，不存在相互竞争的利益。

数字

图1
图1。卡介苗输注到肺泡腔会增强AP的胞吐。
用CFSE标记Staurosporine诱导的凋亡小鼠肺上皮细胞（MLE），并将其转移至经卡介苗或PBS鼻内治疗的小鼠。1h后收集支气管肺泡灌洗（BAL）细胞，用F4/80染色。（A） 显示了单个小鼠的流式细胞术分析。（B） A组游离CFSE+凋亡MLE细胞的平均值和传出细胞效率。传出细胞效率计算为传出细胞CFSE+细胞凋亡的百分比（CFSE+和F4/80+F4/80+双阳性细胞）/CSFE的总百分比+ve（虚拟）细胞。显示了每组3-5只小鼠的两到四个独立实验的代表性。误差条显示SEM。（C)AP内凋亡细胞的定位。将WT小鼠作为A组进行治疗。用红色pHrodo®对凋亡MLE细胞进行染色，并将其滴鼻给药给PBS治疗组（上排）对照组和卡介苗治疗组（下排）。收集BAL细胞并进行共聚焦显微镜放大60x。描述了每组3-4只小鼠的两个独立实验的代表性。（D-F)卡介苗肺部治疗能快速有效地促进疾病状态下AP的胞吐。用卡介苗或PBS滴鼻治疗WT小鼠。两天后，所有小鼠都感染了PR8株流感病毒。IAV感染两天后，所有小鼠均经鼻内注射CFSE标记的凋亡MLE细胞，并通过流式细胞仪测量凋亡细胞清除率，如上所述。（D） 显示了用PBS（顶行）或卡介苗（底行）处理的每只小鼠的流式细胞术分析。（E） 图中显示了面板（D）中游离CFSE+凋亡MLE细胞的平均百分比和胞吐效率。使用面板B中的公式计算AP的胞吐效率。代表三到四个独立实验，每组3-5只小鼠。误差条显示SEM。（F)观察接种卡介苗的小鼠和感染IAV的对照小鼠AP内吞噬的凋亡细胞。WT小鼠如图D所示进行处理。IAV感染后两天，所有小鼠鼻内接受pHrodo®标记的凋亡MLE细胞，并使用共聚焦显微镜研究PBS处理（上排）对照和BCG处理（下排）小鼠AM内凋亡细胞的命运，如图1C所述。放大60倍。描述了每组3只小鼠的两个独立实验的代表性。
图2
图2。卡介苗鼻内治疗可保护小鼠免受致命流感感染。
用PBS或BCG（鼻内或皮下）处理WT小鼠（每组9只），并用致死剂量（2 LD50）的流感PR8病毒感染所有小鼠。每天记录体重减轻（A）和死亡率（B）。（C） 将不同组的小鼠作为A组和B组。流感感染后3天和7天，处死小鼠，生成肺匀浆并测量病毒载量。描述的数据是每组5只小鼠的平均值，误差条显示SEM。NS=不显著。（D） 对IAV感染前后一组卡介苗和PBS治疗小鼠的BAL细胞进行定量。描述的数据是每组5只小鼠的平均值。误差条显示SEM。（E-F）APs的耗尽使卡介苗介导的对致命流感感染的保护失效。小鼠在感染PR8型流感（2LD50）前24小时用卡介苗鼻内注射，并用氯膦酸脂质体或PBS脂质体作为对照。监测受感染小鼠的（E）体重减轻和（F）死亡率。描述了SEM的重量减轻平均值。n=5。DPI：感染后天数。
图3
图3。卡介苗接种增加AP中Tim4的表达。
(A） 用免疫印迹法检测接种卡介苗和对照PBS的小鼠在流感感染前后Tim-4的表达。用卡介苗或PBS治疗WT小鼠，并感染致命的PR8，如图1D和图2所示。流感感染后两天，按照材料和方法收集、汇集和溶解BAL细胞。每条车道都是5只老鼠的BAL池。将每组的等量蛋白质提取物加载到每条车道。（B） 显示了使用Image Lab软件（Bio-Read的分子成像仪凝胶Doc系统）进行的带强度密度分析。数据是3个独立斑点的带密度表示。误差条显示SEM。DPI：感染后天数。
图4
图4。中和Tim4可减少卡介苗介导的AP细胞外吞。
用卡介苗滴鼻治疗WT小鼠，24小时后用200μg抗TIM4阻断抗体或同型对照治疗。第二天，用致死剂量的PR8流感病毒（2LD50）感染所有小鼠。在PR8感染后第2、5和7天，抗体治疗持续3天。（A） 用CFSE标记的凋亡MLE细胞经鼻内转移到经同种（顶行）或抗Tim4（底行）处理的小鼠，一小时后收集BAL，并使用流式细胞术评估AM的粒细胞毒作用，如图1和图3所示。（B） 图中显示了面板（A）中游离CFSE+凋亡MLE细胞的平均百分比和胞吐效率。如图1C和1F所示，计算AM的胞吐效率。两个独立实验的代表是每组3只小鼠。误差条显示SEM。（C和D）每天记录体重下降和死亡率。显示了具有相似结果的两个独立实验的代表性。n=10。
图5
图5。卡介苗对AP中小GTPase表达的影响。
在流感感染前和感染后2天收集用PBS或卡介苗治疗的WT小鼠的AP。提取总RNA，合成cDNA，进行定量逆转录-PCR。β-肌动蛋白被用作看家基因，（a）Rab5和（B）Rab7的表达水平根据β-肌动蛋白mRNA水平进行标准化。（C） 分别使用G-LISA-RhoA和Rac1激活测定方案测量来自BCG或PBS处理的小鼠的AM在流感感染前和感染后2天的Rho A和（D）Rac1活性。每组4-6只小鼠的两个独立实验的代表显示了误差条，如SEM。DPI：感染后天数。
图6
图6。卡介苗对肺部TNF和IL10细胞因子的影响。
WT小鼠按图5所示进行治疗。用实时PCR和ELISA分别检测BAL细胞中TNF（A）和IL10（B）的mRNA表达和BAL上清液（C和D）中的蛋白水平。每组6只小鼠的平均值以误差条显示，误差条显示SEM。DPI：感染后天数。
图7
图7。卡介苗和PBS治疗小鼠BAL样品中PPAR核受体的表达。
采用免疫印迹法检测小鼠肺泡吞噬细胞PPAR-α/β/δ的表达。每条通道都是从3只卡介苗或3只PBS处理过的小鼠中收集的BAL池，这些小鼠分别在感染PR8型流感之前、2（A）和7（B）天后收集。细胞裂解物进行western blot分析。以β-actin为对照。显示了具有类似结果的两个独立实验的代表性。DPI：感染后天数。
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MeSH术语

赠款和资金

这项工作的部分支持来自德克萨斯大学健康科学中心种子基金和空乘医学研究所对H.Shams的资助（092015临床创新奖和123020临床创新奖）。资助者在研究设计、数据收集和分析、出版决定或手稿准备方面没有任何作用。本研究没有收到额外的外部资金。