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.2017年7月6日；7(1):4810.
doi:10.1038/s41598-017-04999-6。

快速扫描离子电导显微镜观察人血小板凝血酶诱导的细胞骨架动力学

扬·塞弗特 1, 约翰内斯·莱茵伦德 1, 弗洛里安·朗 2, 梅恩拉德·加瓦兹 三, 蒂尔曼·施瓦弗 4
附属公司

快速扫描离子电导显微镜观察人血小板凝血酶诱导的细胞骨架动力学

扬·塞弗特等。 科学代表. .

摘要

血小板是参与止血的无核小血细胞。血小板活化，由激动剂如凝血酶或与细胞外基质接触引起，导致血小板粘附、聚集和凝固。活化血小板发生形状变化，粘附并在损伤部位扩散，形成血栓。我们使用快速扫描离子电导显微镜（SICM）研究了完全扩散后人类血小板的形态和形态动力学。与未经刺激的血小板相比，凝血酶刺激的血小板在扩散后表现出更高的形态活性，并以跛足的波浪状运动和血小板体上的动态突起的形式表现出动态形态变化。形态活性的增加取决于凝血酶浓度。暴露于其他激活激动剂或接触诱导激活期间，未观察到活性增加。肌动蛋白聚合抑制和肌动蛋白抑制显著降低凝血酶刺激血小板的活性。我们的数据表明，扩散后的这些形态动力学是凝血酶特异性的，可能在凝血和血栓形成中发挥作用。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
凝血酶刺激血小板的动态形态学。(一)未刺激人类血小板扩散过程的SICM地形图像序列（与表面接触t吨 = 00:00). 摊铺过程后（大约20 分钟），形态没有明显变化。(b条)0.5刺激人血小板扩散过程的图像序列 与表面接触前的凝血酶U/mL。铺展过程完成后，血小板形态呈现动态变化。(c（c）)添加0.5的未刺激扩散血小板的图像序列 U/mL凝血酶t吨 = 00:00. 添加凝血酶后，血小板形态变得动态。添加凝血素前，血小板已被粘附并扩散30 分钟完成铺展过程。(d日)概述扩散凝血酶刺激血小板的血小板外围（顶行）和血小板体（底行）的图像和高速图像序列。记录高速图像序列1和9 min，分别位于概览图像之后。观察到两种动力学模式：血小板外围的跛足波（顶行，箭头，最后一幅图像中的红色痕迹显示运动路径）和血小板体上的动态突起（底行，箭头和最后一幅图中的蓝色痕迹显示运动轨迹）。虚线显示初始血小板边缘（顶行）或初始突出物（底行）。为了增加突出物的对比度，去除了血小板体的大范围弯曲（最下面一行，见“方法”）。完整的图像序列作为补充电影S1–3提供。比例尺：2 微米(一–c（c）), 1 微米(d日).
图2
图2
两种动力学模式。(一)图1c所示凝血酶刺激血小板的追踪跛足波（红色）和突起（蓝色）痕迹。记录道的亮度表示横向速度（各色标）。具有白色、灰色和黑色背景的区域分别被动态血小板永久、暂时和从不覆盖。(b条)平均横向速度和(c（c）)跛足波的平均寿命(n个 = 3种不同血小板上72个）和突起(n个 = 69). (d日)对于所有追踪到的跛足波和突出物，单道（细曲线）的均方距离（MSD，粗体曲线）和均方距离作为时间的函数。每个MSD曲线在以下时间内都显示幂律行为（虚线）t吨 = 60 第条(电子)血小板的形态和形态活性如图a所示。形态活性被定义为每次的高度变化（详见“方法”），并显示血小板形态的局部变化。高活动区域对应于具有快速和频繁移动特征的区域***(P（P） < 0.001）表示存在统计显著差异。误差线：标准偏差。比例尺：2 微米。
图3
图3
不同激动剂激活的扩散血小板的形态活性。(一)在表面接触和扩散之前，不同激动剂刺激的扩散血小板的地形图和活性图。凝血酶刺激（0.5 U/mL）血小板具有较高的形态活性。血小板仅通过接触表面（未刺激）或ADP（20 µM），肾上腺素（20 µM）或花生四烯酸（0.5 µM）在铺展后表现出低的形态活性。高度刻度范围(z（z） 最大值): 2 花生四烯酸为0.8µm 否则为µm。(b条)表面接触（未刺激）、凝血酶、ADP、肾上腺素或花生四烯酸激活的扩散血小板的平均活性(n个 = 各6块血小板）。(c（c）)凝血酶刺激的扩散血小板的平均活性与凝血酶浓度的关系（剂量-反应关系）50第0.13页 单位/毫升(d日)血小板活性与时间的关系t吨 = 0 min.添加后活性显著增加，而添加Tyrode-HEPES缓冲液（对照）后活性保持不变。红色痕迹：面板e显示血小板(电子)添加凝血酶前面板d中红色标记血小板的地形图，以及添加凝血素前后灰色标记时间间隔内血小板的活性图***(P（P） < 0.001）表示统计学上的显著差异。误差条：SEM。比例尺：2 微米。
图4
图4
凝血酶刺激的扩散血小板中细胞骨架成分和运动蛋白的抑制。(一)添加肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D（10 µM）t吨 = 0 最小对照：添加不含细胞松弛素D的溶剂(b条)在添加细胞松弛素D前后的灰色标记时间间隔内，a组血小板的地形图和活性图(c（c）)凝血酶刺激血小板的活性随时间的变化，并添加特异性肌动蛋白抑制剂西利奥布雷文D（100 µM）或广谱动力蛋白抑制剂EHNA（1 mM）在t吨 = 0 最小控制：添加不含相应抑制剂的溶剂。(d日)添加纤维连接蛋白D或EHNA前后灰色标记时间间隔内，c组血小板的地形图和活性图。(电子)平均形态活性与纤维素D浓度的关系。(（f）)不同细胞骨架和运动蛋白抑制剂处理的凝血酶刺激血小板的平均形态活性(n个 = 每个7块血小板）。与细胞松弛素D、纤维连接蛋白D或EHNA相比，肌球蛋白II抑制剂blebbistin（100 µM），岩石抑制剂Y-27632（50 µM），微管聚合抑制剂诺卡唑（33 µM）或驱动蛋白ATP酶抑制剂ATA（10 µM）对活性没有显著影响。相应的图像序列作为补充电影S4和S5提供*(P（P） < 0.05）和***(P（P） < 0.001）表示具有统计学意义的差异。误差线：SEM。比例尺：2 微米。
图5
图5
凝血酶刺激的扩散血小板中细胞骨架成分的定位。(一)凝血酶刺激血小板与甲醛固定前后的SICM地形图图像序列。(b条)固定前血小板的地形图和活性图。(c（c）)固定血小板中细胞骨架成分F-actin、α-微管蛋白和动力蛋白中间链的共焦荧光图像。白色虚线表示各SICM地形图中固定血小板的轮廓。比例尺：2 微米。
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