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.2017年7月4日；7(1):4572.
doi:10.1038/s41598-017-04783-6。

细胞外基质促进催乳素依赖于网格蛋白的内吞和STAT5在乳腺上皮细胞分化中的激活

丽贝卡·E·布里奇沃特 1, 查尔斯·斯特雷利 1, 帕特里克·T·卡斯维尔 2
附属公司

细胞外基质促进催乳素依赖于网格蛋白的内吞和STAT5在乳腺上皮细胞分化中的激活

丽贝卡·E·布里奇沃特等。 科学代表. .

摘要

催乳素通过其同源受体和下游JAK2-STAT5a信号通路促进乳腺上皮细胞（MECs）的泌乳分化。反过来，它调节乳蛋白基因的转录。催乳素信号依赖于通过β1整合素与基底膜细胞外基质（ECM）的相互作用，β1整合素激活ILK和Rac1，是STAT5a激活和泌乳分化所必需的。细胞内吞是信号传导的重要调节器。它既能增强又能抑制细胞因子信号，尽管内吞对催乳素信号的作用尚不清楚。在这里，我们表明，氯氰菊酯介导的内吞作用是ECM-依赖性STAT5激活所必需的。在ECM存在的情况下，催乳素通过依赖于网格蛋白但依赖于小窝蛋白的途径内化。这独立于JAK2和Rac信号传导，但对STAT5的完全磷酸化和激活是必需的。催乳素被内化到早期内体中，其中主要的早期内体调节因子Rab5b促进STAT5磷酸化。这些数据揭示了ECM驱动的内吞在细胞因子信号的正向调节中的新作用。

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利益冲突声明

作者声明，他们没有相互竞争的利益。

数字

图1
图1
抑制内吞抑制MEC中STAT5的激活。(A类)2D泌乳分化模型示意图。(B类)将Eph4细胞接种到塑料上，并酌情将LrBM添加到分化培养基中。24天后 小时，用Prl（3  μg/ml），如15所示 裂解前分钟。样品通过SDS-PAGE/蛋白印迹和磷酸钇进行分析694STAT5、总STAT5a或微管蛋白特异性抗体，以及使用ImageJ对Odyssey扫描荧光图像进行量化。(C类——E类)：Eph4细胞，如中所示(A类)使用Dyngo4（60 µM），Pitstop II（18 µM），菲律宾III（8 μM）或二甲基亚砜，如Prl刺激前所示，并按(A类). Western blot具有代表性，图表显示了来自至少3个独立实验的标准化数据*第页 < 0.05，**p.0.01****p.0.0001，纳秒 = 不重要。
图2
图2
氯菊酯促进LrBM增强的MEC中催乳素诱导的STAT5激活。(A类,B类)CHC-特异性SMARTpool转染Eph4细胞(A类)或单个寡核苷酸(B类)接种到塑料上，并酌情将LrBM添加到分化培养基中。24天后 小时，用Prl（3 μg/ml），如15所示 裂解前分钟。样品通过SDS-PAGE/蛋白印迹和磷酸钇进行分析694STAT5、总STAT5a或微管蛋白特异性抗体，以及使用ImageJ对Odyssey扫描荧光图像进行量化。(C类)用Caveolin-1特异性SMARTpool或单个寡核苷酸转染的Eph4细胞按(A类). 蛋白质印迹是至少3个独立实验的代表，图表显示了这些实验的归一化数据*第0.05页，**p < 0.01纳秒 = 不显著。
图3
图3
催乳素通过CME在LrBM增强的MEC中内化。(A类)Prl内化分析示意图。(B类)接种在塑料上的Eph4细胞酌情覆盖LrBM，并用Prl（3）标记  μg/ml） 15°C 分钟。用PBS洗涤细胞以显示总结合Prl（total），或酸洗以显示内化的Prl。(C类)用Prl（3）标记Eph4细胞 μg/ml）15 37分钟 °C或4 °C如所示，总池和内部池分析如所示(B类). 使用ImageJ对奥德赛扫描荧光图像进行量化。黄线表示不存在外源性Prl时的背景信号。(D类,E类)分析CHC和Caveolin-1敲除细胞（每个细胞有2个寡核苷酸）中的Prl内化，减去缺乏外源性Prl的背景信号，得出高于背景的相对内部Prl。蛋白质印迹是至少3个独立实验的代表，图表显示了这些实验的归一化数据*第页 < 0.01，**p.0.001，纳秒 = 不重要。
图4
图4
抑制Rac或JAK2可防止STAT5磷酸化，而不会影响催乳素内吞。将Eph4细胞接种到塑料上，并酌情将LrBM添加到分化培养基中。24天后 小时后，用抑制剂（JAK2抑制剂（AZD-1480，10 微米；(A类——C类)或Rac抑制剂（EHT 1864，25–100 微米；D-E））用于15 分钟，然后用Prl刺激（3 μg/ml），如15所示 酸洗细胞前分钟，去除表面Prl并进行裂解。样品通过SDS-PAGE/蛋白印迹和磷酸钇进行分析694STAT5、总STAT5a、Prl或微管蛋白特异性抗体，以及相对STAT5磷酸化的定量(B类,E类)和Prl内部化(C类,F类)来自使用ImageJ执行的Odyssey扫描荧光图像。黄线表示没有外源Prl时的背景信号。蛋白质印迹是至少3个独立实验的代表，图表显示了这些实验的归一化数据*第页<0.01; **p.0.001，***p.0.0001，纳秒 = 不重要。
图5
图5
催乳素内化到早期内体是分化MEC时Prl信号传递所必需的。(A类)将Eph4细胞接种到塑料上，并酌情将LrBM添加到分化培养基中。24天后 小时，用未标记或标记的Prl（3 μg/ml），如15所示 裂解前分钟。样品通过SDS-PAGE/蛋白印迹和磷酸钇进行分析694STAT5、总STAT5a或微管蛋白特异性抗体。(B类——E类)将Eph4细胞接种在玻璃盖玻片上，并酌情将LrBM添加到分化培养基中。24天后 小时，用标记的Prl（3 μg/ml），如15所示 肌动蛋白和细胞核固定和染色前分钟(B类)或EEA1和核(D类). 共聚焦叠加被捕获，并显示了代表性的最大强度投影。内部Prl颗粒(C类)和与EEA1共定位的内化颗粒(E类)使用ImageJ进行分析。F： 处理Rab5b敲除细胞，并测定STAT5磷酸化(A类)以及使用ImageJ对奥德赛扫描荧光图像进行量化。蛋白质印迹和图像是至少3个独立实验的代表，图表显示了归一化数据*第页 < 0.01，**p.0.001，纳秒 = 不重要。
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