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.2017年6月30日;12(6):e0179995。
doi:10.1371/journal.pone.0179995。 2017年电子收集。

在人类三维多细胞肝纤维化模型中,原纤维化合物诱导星状细胞活化、ECM重塑和Nrf2活化

附属公司

在人类三维多细胞肝纤维化模型中,原纤维化合物诱导星状细胞活化、ECM重塑和Nrf2活化

Vincenzo Prestigiacomo公司等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

背景和目标:目前,大多数肝纤维化研究都是在体内进行的,因为缺乏能够概括导致肝纤维化的细胞事件的合适的替代体外系统。在这里,我们旨在生成一个包含代表肝纤维化三个关键参与者(肝细胞、枯否细胞和星状细胞)的细胞的系统,并评估其对促纤维化化合物(如TGF-β1、甲氨蝶呤(MTX)和硫代乙酰胺(TAA))的反应。

方法:使用InSphero挂滴技术共同培养代表肝细胞(HepaRG)、枯否细胞(THP-1巨噬细胞)和星状细胞(hTERT-HSC)的人类细胞系,以生成无支架的3D微组织,并用原纤维化合物(TGF-β1、MTX、TAA)处理该微组织长达14天。通过测定细胞因子(TNF-α、TGF-β1和IL6)的表达、ECM蛋白的沉积和分泌以及纤维化生物标志物(如αSMA)基因表达的诱导来评估微问题的反应。作为防御机制的关键参与者,Nrf2和Keap1的诱导也进行了评估。

结果:我们可以证明,基于激活标记物的低表达水平,多细胞3D微问题培养物可以保持在非激活状态。巨噬细胞被LPS激活,hTERT-HSC被TGF-β1激活。此外,MTX和TAA诱发了纤维化表型,通过ECM蛋白(如胶原蛋白和纤维连接蛋白)的基因表达和蛋白沉积进行评估。此外,还观察到原纤维化合物刺激后抗氧化途径的参与。

结论:在这里,我们首次证明了导致肝纤维化的关键分子和细胞事件的体外重演:肝细胞损伤、抗氧化防御反应、Kupffer细胞激活和HSC激活导致ECM沉积。

PubMed免责声明

利益冲突声明

竞争利益:作者声明,他们没有可能影响数据生成或解释的利益冲突。

数字

图1
图1。TNF-α和TGF-β1促进hTERT-HSC单层培养中α-SMA的产生。
hTERT-HSC细胞用TNF-α(50ng/mL)或TGF-β1(1ng/mL)处理2、5或10天。处理后,将细胞固定并与αSMA(绿色)和细胞核(DAPI,蓝色)进行染色。使用荧光显微镜拍摄的照片。比例尺:50μm。
图2
图2。LPS诱导PMA处理的THP-1细胞产生TNF-α。
在暴露于1μg/mL LPS之前,用0、5、10和25 ng/mL PMA处理THP-1 48小时。用ELISA法测定48小时培养上清中TNF-α的浓度。这些发现表明,PMA分化的THP-1细胞分化良好,但对随后的低浓度LPS反应充分。值显示为重复值。
图3
图3。用HepaRG-cells或HepaRGs/THP-1/hTERT-HSC产生的福尔马林固定石蜡包埋人微组织染色。
用苏木精和伊红(H&E)、间充质NPC标记物波形蛋白和巨噬细胞标记物CD68对微组织进行染色。在进行组织学染色之前,将微组织培养14天。共培养系统显示波形蛋白和CD68阳性染色,表明存在三种不同的细胞类型。箭头表示CD68阳性细胞。波形蛋白染色图片的缩放显示树突状星状细胞。比例尺:200μm(20倍放大)和100μm(40倍放大)。
图4
图4。用原纤溶化合物治疗的人类肝脏微组织的活性反应。
(A) MTT法检测LPS、TNF-α和TGF-β1对人肝微粒体存活率的影响。暴露于受试化合物14天后,用0.5mg/mL MTT溶液培养微组织4h。然后将DMSO和Sörensen缓冲液添加到微孔中,并使用FlexStation 3在550nm处读取吸光度。数值以阴性对照的百分比表示。*;P≤0.05,**;P≤0.01,***;与车辆控制相比,P≤0.001。(n=6,平均值±SD)。(B) MTX、TAA和TGF-β1对ATP生成的影响。使用CellTiter-Glo测量ATP含量®暴露于MTX、TAA和TGF-β1 14天后,发光细胞活性测定2.0。数值以阴性对照的百分比表示。***;P≤0.001 vs车辆控制(n=6,平均值±SD)。
图5
图5。暴露于LPS、TNF-α和TGF-β1的人肝微组织中纤维化标记物和细胞因子的基因表达。
使用TRIzol常规程序提取mRNA,计算每个样品和载体对照的折叠诱导率为2^(-ΔΔCT),并表示为三个重复的平均折叠诱导率±S.E.M,每个重复六个MT。肌动蛋白被用作每个样本的参考基因。†16个微观问题作为重复问题进行分析;未对这些样本进行统计分析。ND:无检测值。*;P≤0.05,**;P≤0.01,***;与车辆控制相比,P≤0.001。
图6
图6。肝脏微组织中的白蛋白生成和细胞增殖。
MTX、TAA和TGF-β1治疗14天后,用白蛋白和Ki67抗体对HepaRG/THP-1巨噬细胞/hTERT-HSC微组织福尔马林固定石蜡包埋切片进行染色。在石蜡化之前,将微组织固定在4%PFA中,并嵌入2%琼脂糖中。MTX、TAA、尤其是TGF-β1暴露后,微组织白蛋白生成减少。Ki67在TGF-β1暴露后显示出对微组织细胞增殖的强烈诱导作用。比例尺:200μm。图形显示定量IHC染色值(QISV)为平均值±S.D.(N=5)。*;P≤0.05,**;P≤0.01,***;与车辆对照组相比,P≤0.001。
图7
图7。暴露于MTX、TAA和TGF-β1后福尔马林固定石蜡包埋人体微细组织的免疫染色。
MTX、TAA和TGF-β1治疗14天后,HepaRG/THP-1巨噬细胞/hTERT-HSC微组织福尔马林固定石蜡包埋切片用苏木精和伊红(H&E)、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(αSMA)、I型胶原和CD68染色。在石蜡化之前,将微组织固定在4%PFA中,并嵌入2%琼脂糖中。MTX、TAA和TGF-β1暴露后,微组织中波形蛋白、αSMA、I型胶原和CD68阳性细胞增加。波形蛋白和CD68染色显示微组织中的星状细胞和THP-1巨噬细胞增殖,表明炎症过程开始,而αSMA和胶原I则表明星状细胞激活和胶原沉积。比例尺:200μm。图形显示定量IHC染色值(QISV)为平均值±S.D.(N=5)。*;P≤0.05,**;P≤0.01,***;与车辆控制相比,P≤0.001。
图8
图8。MTX和TAA对人肝微组织纤维化标记物基因表达的影响。
使用TRIzol常规程序提取mRNA,计算每个样品和阴性对照的折叠诱导率为2^(-ΔΔCT),并表示为三个重复的平均折叠诱导率±S.E.M.,每个重复六个MT。肌动蛋白被用作每个样本的参考基因;P≤0.05,**;P≤0.01,***;与车辆控制相比,P≤0.001。
图9
图9。微组织暴露于原纤维化合物后,上清液培养基中胶原蛋白I和MMP2的分泌。
暴露于MTX、TAA和TGF-β1.*后14天,用ELISA法评估上清液中的蛋白质含量;P≤0.05,**;P≤0.01,***;P≤0.001 vs车辆控制(n=4,平均值±SD)。
图10
图10。肝损伤后肝星状细胞、库普弗细胞和肝细胞之间的分子信号传导。
图中显示了肝损伤后,如原纤维化合物(MTX和TAA),产生基质的肝星状细胞与肝旁巨噬细胞和肝细胞之间潜在的复杂相互作用。其中一些交互作用之前已经发布过,一些得到了我们数据的支持,还有一些仍然是推测性的。在我们的肝脏微组织中,THP1巨噬细胞(作为Kupffer细胞的替代物)产生了大量的TNF-α、IL6和TGF-β1,通过基因表达增加检测到。HepaRG(类肝细胞)在特异性刺激后也产生细胞因子(IL-6),如LPS和TNF-α,并在暴露于TGF-β1后表现出肝细胞损伤,白蛋白染色减少。细胞因子能够增强星状细胞活化(αSMA生成增加)和胶原沉积。此外,在高浓度MTX和TAA下,氧化相关基因(如Nrf2和Keap1)的表达增加,表明参与了这种细胞防御。箭头表示测量的参数。

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引用人

工具书类

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