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.2017年6月30:6:e28029。
doi:10.7554/eLife.28029。

BK和Ca之间的近距离聚集V（V）1.3通道在低压下促进功能耦合和BK通道激活

奥斯卡·维瓦斯 1 2, 克劳迪娅·莫雷诺 1 2, 路易斯·桑塔纳 2, 贝蒂尔·希尔 1
附属公司

BK和Ca之间的近端聚集V（V）1.3通道在低压下促进功能耦合和BK通道激活

奥斯卡·维瓦斯等。 埃利夫. .

摘要

钙V（V）-BK通道的通道依赖性激活对钙内流和细胞兴奋性的反馈控制至关重要。这里我们讨论了BK和Ca之间的功能和空间相互作用V（V）1.3通道，独特的CaV（V）1个在低电压下激活的通道。我们发现当BK和CaV（V）1.3个通道在同一细胞中共表达，BK通道在-50 mV附近开始激活，比共表达BK和高压激活Ca的激活负约30 mVV（V）2.2通道。此外，单分子定位显微镜显示了引人注目的钙团簇V（V）1.3条围绕BK通道簇的通道，在异源系统、大鼠海马和交感神经元中形成多通道复合体。我们建议，这种空间安排允许在局部BK通道激活和Ca门控之间紧密跟踪V（V）1.3通道处于非常负的膜电位，有助于在接近激发动作电位阈值的电压下调节神经元的兴奋性。

关键词：BK通道；生物物理；地面消耗；海马神经元；大鼠；结构生物学；超分辨显微镜；交感神经元；电压门控钙通道。

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数字

图1。
图1.通过与不同Ca的共表达改变BK通道的激活谱V（V）频道。
(A类)在仅转染Ca的tsA-201细胞中，通过上述电压方案激活的代表性钙敏感内向（负）钙电流V（V）2.2或CaV（V）1.3通道。(B类)平均电导-电压(G–V型)钙的关系V（V）2.2通道（绿色圆圈，n=8）和CaV（V）1.3个通道（绿色方块，n=9）显示CaV（V）1.3通道在比Ca更多的负电位下激活V（V）2.2通道。(C类)在与BK+Ca共转染的tsA-201细胞中，以相同电压方案（如上）激活的代表性外向（正）钾电流V（V）施用镉前后的2.2个通道。减去的电流显示内向的钙电流（箭头），然后是外向的钾电流。(D类)与中相同C类但tsA-201细胞与BK+Ca共转染V（V）1.3通道。(E类)与Ca共表达的BK通道的平均G-V关系V（V）2.2（红色圆圈，n=9）或CaV（V）1.3个通道（红色方块，n=7）表明当被钙激活时，BK通道以更多的负电位激活V（V）比Ca激活时低1.3V（V）2.2. 箭头指向激活阈值。中的平滑G-V曲线(B类)和(E类)已安装Boltzmann函数：G/Gmax=1/（1+exp(-(电压-电压中间)/斜坡))，其中V（V）是膜电压，V（V）中间是半最大激活电压，以及斜坡描述了通道选通的电压依赖性。对于中的曲线(B类)、加州V（V）参数V（V）中间和斜坡Ca为−37 mV和4 mVV（V）Ca为1.3和−2 mV和4 mVV（V）2.2. 对于中的曲线(E类)，BK参数为−17 mV和12 mV（含Ca）V（V）1.3和+16 mV以及12.3 mV（含Ca）V（V）2.2.内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.002
图1——图补充1。
图1：补充图1：tsA-201细胞中的BK电流需要Ca的共同表达V（V）1.3通道。
仅转染BK通道（空圈，n=8）或BK和Ca的tsA-201细胞的平均电流-电压曲线V（V）1.3个通道（红色方块，n=7）表明钙通过钙流入V（V）需要激活该表达系统中的BK通道。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.003
图1—图补充2。
图1-图补充2：当与钙结合时，BK通道的激活较慢V（V）2.2通道。
(A类)不同电压下Ca电流的激活时间常数V（V）1.3（黑色方块）或CaV（V）2.2（红圈）通道在tsA-201细胞中表达。(B类)与Ca共表达的BK通道不同电压下电流的激活时间常数V（V）1.3（黑色方块）或CaV（V）2.2（红色圆圈）通道。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.004
图2。
图2..BK和CaV（V）1.3通道足够近，可以在小的膜片中记录并通过免疫共沉淀进行检测。
(A类)表达BK和Ca的tsA-201细胞的典型单通道记录V（V）1.3通道。在细胞连接模式下进行记录，通过1s电压阶跃至0 mV激发外向（正）BK电流，足以激活CaV（V）在镀液中连续应用10μM硝苯地平和500 nM帕罗西林，BK通道开口减少。使用pClamp 10.2的单通道事件检测算法测量单通道打开幅度，并计算通道数乘以打开概率（NPo（o）). (B类)BK通道活性的量化（NPo（o）)从中的每个条件A类. (C类)（左凝胶）Western blot检测仅转染BK cDNA或BK和Ca的tsA-201细胞中的BK通道蛋白V（V）1.3 cDNA。当细胞未转染或仅Ca时，未检测到BK通道V（V）1.3 cDNA转染。单体BK通道的分子量约为130KDa。位于250KDa左右的带可能对应于二聚体。（右凝胶）在Ca下拉测定中检测BK通道V（V）1.3抗体（来自独立实验的3个凝胶）。如果蛋白质被非特异性IgG拉下，则未检测到BK通道。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.005
图2——图补充1。
图2-图补充1.原始BK单通道记录。
(A类)转染Ca的tsA-201细胞的原始单通道记录V（V）1.3和BK通道通过0 mV的电压指令激活。保持电位为−80 mV。箭头指向BK通道开口。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.006
图3。
图3钙激活BK通道V（V）1.3通道被快速钙缓冲液阻断。
(A类)实验策略图。BAPTA将缓冲距离钙源10 nm以上的钙。EGTA将在距离钙源100 nm以外的地方缓冲钙。(B类)与钙共存的BK通道电流-电压关系的比较V（V）1.3通道，用控制移液管溶液（空白圆圈，n=5）、含EGTA的溶液（蓝色方块，n=6）或含BAPTA的溶液（黄色方块，n=7）测量。在全细胞配置中进行记录。(C类)与钙共存的BK通道电流-电压关系的比较V（V）2.2通道，用控制移液管溶液（空圈，n=7）、含EGTA的溶液（蓝色方块，n=9）或含BAPTA的溶液（黄色方块，n=7）测量。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.007
图4。
图4.CaV（V）1.3通道优先分布在靠近BK通道的地方。
(A类)共表达BK（红色）和Ca的细胞的三个代表性单分子定位图V（V）1.3（绿色）通道，显示由若干Cav1.3通道簇包围的单个BK通道簇。(B类)共表达BK（红色）和Ca的细胞的三个代表性单分子定位图V（V）2.2（青色）通道，显示BK和Ca之间没有特殊关联V（V）2.2通道。(C类)BK正团簇到Ca距离的频率分布V（V）1.3阳性（绿色，n=5个细胞）或CaV（V）2.2阳性（青色，n=4个细胞）簇。(D类)基于Ca所占面积百分比的分布分析V（V）1.3簇（绿色方块，n=5个单元），CaV（V）2.2簇（青色圆圈，n=4个细胞）或随机CaV（V）1.3簇（橙色圆圈，n=5个细胞）作为与BK通道距离的函数。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.008
图4——图补充1。
图4补充1。tsA-201细胞中α-微管蛋白的单分子定位图。
(A类)（左）微管共焦模式或（中）单分子定位模式的TIRF图像。（右）从显示单个微管的中间白色方形图像中放大。(B类)单个微管横向剖面的频率分布（来自3个细胞的44个ROI）。剖面在中心对齐，标记为0 nm。用高斯曲线（红色曲线）拟合剖面图，得出单个微管的预期宽度，即全宽半最大值（FWHM），这与之前报道的微管宽度值一致（Burnette等人，2011；Dempsey等人，2011）。使用相同的设置获取BK和Ca的单分子定位图V（V）1.3通道。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.009
图4——图补充2。
图4补充了2。超分辨率成像中波长通道之间的微小漏气。
(A类). 用与Alexa-568结合的二级抗体对tsA-201细胞进行α-微管蛋白免疫染色，并在568（绿色）和647（红色）通道中超分辨率成像。(B类). 与A中相同，但二级抗体与Alexa-647结合。(C类). Alexa-568或Alexa-647染料定位到568通道（绿色条）或647通道（红色条）的分数。Alexa-568染料在647通道中的定位分数对应于漏出，Alexa-647染料则相反。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.010
图4——补充图3。
图4-图补充3：BK和Ca的控制单分子定位图V（V）tsA-201细胞中的1.3个通道。
(A类)未转染Ca的tsA-201细胞图V（V）1.3通道，并用抗Ca的第一抗体进行免疫染色V（V）1.3. (B类)未转染BK通道cDNA并用抗BK一级抗体免疫染色的tsA-201细胞的图谱。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.011
图4——图补充4。
图4-图补充4.BK CaV（V）1.3聚集不是固定的伪影。
BK-GFP（绿色）和CaV（V）1.3将橡胶（红色）转染到tsA-201细胞中，并在AiryScan显微镜下成像。细胞未固定。三个区域的放大显示在右侧面板中。注意Ca的分布V（V）在活细胞中还观察到BK簇周围有1.3个通道。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.012
图4——补充图5。
图4补充了图5。随机单分子定位图的生成和分析。
(A类)转染BK和Ca的tsA-201细胞的代表性原始单分子定位图V（V）1.3通道。次要抗体是针对BK通道（红色，左侧）的Alexa-647和针对Ca的Alexa-568V（V）1.3通道（绿色，中间）。右图显示合并的红色和绿色信号。（插图）从合并图像中的白色方块放大。(B类)生成随机图像。红色图像完好无损（左）。A中的绿色图像是随机的（中间），保持绿色颗粒的数量、大小和形状不变。右图显示合并的红色和随机绿色信号。（插图）从合并图像中的白色方块放大。(C类)基于Ca所占面积百分比的分布分析V（V）1.3簇（绿色正方形）或随机绿色粒子（橙色圆圈）作为与BK通道距离的函数。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.013
图5。
图5内源性BK和CaV（V）1.3通道也在神经元中形成簇。
(A、 B)培养海马的典型单分子定位图(A类)和同情(B类)标记BK（红色）和Ca的神经元V（V）1.3（绿色）通道；右侧放大面板显示了被Ca包围的BK通道簇V（V）1.3通道。(C、 E类)基于Ca所占面积百分比的分布分析V（V）1.3簇（绿色方块）或随机CaV（V）1.3簇（橙色圆圈，n=6）作为海马BK通道距离的函数(C类，n=6）和同情(E类，n=7）个神经元。(D、 F类)海马应用500 nM帕西林前后在低负电位（−40 mV，见电压协议）下激活的外向电流(D类，n=3）和同情(F类，n=3）个神经元。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.014
图5——图补充1。
图5——补充图1.抗Ca的特异性V（V）1.3表达Ca的tsA-201细胞中的抗体V（V）1.3和CaV（V）1.2通道。
(A类)（顶部）Ca示意图V（V）1.3和CaV（V）1.2蓝色通道描绘II-III细胞内环。（底部）显示抗Ca抗体识别的表位的II-III细胞内环路的序列同源性V（V）1.3抗体。两个序列之间的非保守氨基酸显示为红色(B类)（左）表达Ca的代表性tsA-201细胞的单分子定位图V（V）1.3和CaV（V）1.2-EGFP通道和抗Ca免疫染色V（V）1.3（绿色，Alexa-568作为2ry抗体）和抗GFP（红色，Alexa-647作为2ry抗体）抗体。（右）来自同一细胞不同区域的放大面板，描绘了两种抗体的不同免疫染色模式。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.015
图5——图补充2。
图5——补充图2.BK和Ca的聚类V（V）1.3通道独立于所使用的二级抗体。
BK和Ca的典型单分子定位图V（V）1.3集群。注意，在这种情况下，CaV（V）1.3抗体用与Alexa-647偶联的二级抗体标记（绿色），BK抗体用与Alexa-568偶联的二次抗体标记（红色）。与图5类似，绿色像素表示Ca的存在V（V）1.3个通道，而红色像素表示存在BK通道。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.016
图5——补充图3。
图5补充了图3。交感神经元在低电压下L型钙通道的单通道活性。
(A类)用含有200μM Rhod-2和10 mM EGTA的移液管以全细胞模式修补交感神经元（SCG）的图像。(B类)与中的单元格相同(A类)但使用TIRF显微镜观察细胞的荧光足迹。(C、 D类)交感神经元中以绿色圆圈标记的部位的自发钙事件（火花）和钙浓度的时间进程（底部）的TIRF图像（顶部）(C类)或之后(D类)500 nM BayK的应用。膜电位保持在-80 mV。红色虚线表示连续量子水平的振幅。内政部： http://dx.doi.org/10.7554/eLife.28029.017
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