LPS alters the immuno-phenotype of glioma and glioma stem-like cells and induces in vivo antitumor immunity via TLR4

doi:10.1186/s13046-017-0552-y

.2017年6月22日；36(1):83.

doi:10.1186/s13046-017-0552-y。

LPS通过TLR4改变胶质瘤和胶质瘤干细胞的免疫表型并诱导体内抗肿瘤免疫

盛汉¹, 王超（Chao Wang）¹, 秦晓飞¹, 夏俊哲¹, 吴安华²

附属公司

¹中国沈阳市和平区南京街155号中国医科大学第一医院神经外科，110001。
²中国沈阳市和平区南京街155号中国医科大学第一医院神经外科，110001。cmuwuanhua@aliyun.com。

PMID： 28641579
预防性维修识别码： PMC5480420型
内政部： 10.1186/s13046-017-0552年

LPS通过TLR4改变胶质瘤和胶质瘤干细胞的免疫表型并诱导体内抗肿瘤免疫

盛汉等。实验临床癌症研究杂志. 2017.

.2017年6月22日；36(1):83.

doi:10.1186/s13046-017-0552-y。

作者

盛汉¹, 王超（Chao Wang）¹, 秦晓飞¹, 夏俊哲¹, 吴安华²

附属公司

¹中国沈阳市和平区南京街155号中国医科大学第一医院神经外科，邮编110001。
²中国沈阳市和平区南京街155号中国医科大学第一医院神经外科，110001。cmuwuanhua@aliyun.com。

PMID： 28641579
预防性维修识别码： PMC5480420型
内政部： 10.1186/s13046-017-0552年

摘要

背景：本研究检测了脂多糖（LPS）在体外影响胶质瘤和胶质瘤干细胞（GSCs）并在体内诱导抗肿瘤免疫的能力，以及TLR4在这些过程中的作用。

方法：采用RT-PCR和免疫组织化学方法，我们检测了34例胶质母细胞瘤临床标本中TLR4的表达。采用实时PCR、western blot和ELISA分析，评估LPS刺激对RG2和U87 GSC中免疫相关分子表达的影响。对照组或LPS预处理的RG2 GSC经颅内或皮下植入野生型或裸鼠Fisher 344大鼠。组织病理学检查用于评估肿瘤进展和免疫浸润，Kaplan-Meier分析用于比较动物模型的生存时间。

结果：TLR4在胶质母细胞瘤临床标本中高表达。体外LPS刺激6小时显著改变RG2和U87 GSC中免疫相关分子的表达。然而，长时间的LPS刺激减弱了这种效应。脑内接种LPS预处理的RG2 GSC的大鼠存活时间显著长于接种对照RG2 GSCs的大鼠。在体内，LPS预处理的RG2 GSCs表达更高水平的MHC分子、CXCL10和TNF-α，并募集更多的CD8⁺淋巴细胞。然而，瘤内LPS治疗并没有同样的益处。此外，LPS刺激的体内外效应似乎在很大程度上依赖于TLR4。

结论：当肿瘤宿主的免疫功能完好无损时，LPS预处理可促进体内肿瘤GSC的识别和根除。此外，我们的数据表明细菌感染与胶质瘤预后之间存在复杂的关系。

关键词：脂多糖；生存；Toll样受体4；胶质瘤干样细胞。

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数字

图1
TLR4在胶质瘤细胞中的表达。显示了具有代表性的图像。一-b条:*TLR4级*RT-PCR检测胶质母细胞瘤临床标本中mRNA和蛋白的表达(一)和western blot(b条).c（c）：用免疫组织化学方法检测TLR4蛋白在胶质母细胞瘤中的表达和定位。d日：神经球由CD133和从RG2和U87细胞分离的巢蛋白阳性胶质瘤干细胞（GSC）组成。western blot检测并比较GSC和亲代细胞中CD133和nestin的表达。**e（电子）**：GSC粘附并分化为GFAP-或βIII微管阳性细胞。**（f）**-克：通过RT-PCR测定RG2和U87 GSC中TLR4的表达(**（f）**)和western blot(克)

图2
体外LPS刺激改变胶质瘤细胞和GSC的免疫表型。一：LPS刺激6、12或24小时后*MHC-I公司*,*MHC-II型*,*CD80型*,*CD86型*,*肿瘤坏死因子-α*,*白介素-6*,*白介素-10*,*转化生长因子-β1*、和*转化生长因子-β2*用实时PCR检测mRNA。b条：LPS刺激6、12或24小时后*MHC-I公司*,*MHC-II型*,*CD80型*,*CD86型*,*肿瘤坏死因子-α*,*白介素-6*,*白介素-10*,*转化生长因子-β1*、和*转化生长因子-β2*用western blot检测RG2和U87 GSC中的蛋白。**c（c）**：LPS刺激6、12或24小时后，用ELISA法检测胶质瘤细胞和GSC的无细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10的分泌水平。d日：LPS刺激6h后，用免疫荧光染色法检测RG2 GSC中MHC-I、MHC-II、CD80和CD86的表达。显示了具有代表性的图像。结果显示为平均值 ± 来自三个独立实验的三份样品的SEM**P（P）* <0.05, ***P（P）* <0.01, ****P（P）* <0.001

图3
体外LPS刺激改变依赖TLR4的胶质瘤细胞和GSC的免疫表型。一：通过western blot分析确定的特定shRNA可以稳定地抑制RG2和U87 GSC中TLR4的表达。b条-**c（c）**：在对照shRNA细胞中，LPS刺激6 h后，MHC-I、MHC-II、CD80、CD86、TNF-α和IL-6表达增加，但实时PCR检测到IL-10表达降低(b条)和western blot(**c（c）**). 然而，在*TLR4级*-shRNA，LPS刺激的作用被取消。d日：LPS刺激6h后，用ELISA法检测RG2-control-shRNA和RG2的无细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-10的分泌水平-*TLR4级*-shRNA GSCs。**e（电子）**：通过免疫荧光染色和蛋白质印迹测定，LPS刺激6小时后，RG2 GSCs中CXCL10以TLR4依赖性方式上调。比例尺，25μm。显示了具有代表性的图像。结果显示为平均值 ± 来自三个独立实验的三份样品的SEM**P（P）* <0.05, ***P（P）* <0.01, ****P（P）* <0.001

图4
LPS刺激对RG2细胞增殖和侵袭的影响。一：对照组或LPS处理的RG2细胞在不同时间点的代表性显微照片。b条–**c（c）**：通过细胞计数检查LPS刺激对细胞增殖的影响(b条)和MTT分析(**c（c）**).d日：持续LPS刺激48和72小时后，通过细胞计数测定RG2细胞的增殖。**e（电子）**-**（f）**：LPS刺激6h后，用TUNEL法检测RG2细胞的凋亡。**e（电子）**：代表性显微照片。F：统计分析，凋亡率按以下公式计算：阳性细胞/（阳性细胞 + 阴性细胞） × 100%.克-小时：通过Transwell分析测定LPS刺激6、12或24小时对RG2细胞侵袭能力的影响。克：代表性显微照片。小时：统计分析。一： RG2 GSC的自我更新能力，由神经球形成实验测定。显示了RG2 GSC形成的神经球的代表性图像和三个独立实验的定量分析。结果显示为平均值 ± 来自三个独立实验的三份样品的SEM

图5
LPS预处理的体内效应。一：Kaplan-Meier曲线的对数库分析显示，接种LPS预处理RG2 GSC的野生型大鼠的存活时间显著延长。b条：在免疫功能完整的野生型大鼠中，LPS预处理显著抑制颅内肿瘤生长。左，颅内肿瘤代表性图像，比例尺2 mm；对，定量分析。**c（c）**：LPS预处理的存活益处取决于RG2 GSC中TLR4的表达。d日：Kaplan-Meier曲线的对数库分析显示，与对照大鼠相比，LPS治疗（第0天）大鼠的存活率略有增加，这与RG2 GSC中TLR4的表达无关。**e（电子）**：Kaplan-Meier曲线的对数库分析显示，与对照大鼠相比，LPS治疗（第5天）大鼠的存活率没有显著增加。**（f）**-克：裸鼠存活率(**（f）**)和颅内肿瘤生长(克)LPS预处理组未受影响。小时-n个：HE染色(小时)免疫组织化学染色显示LPS预处理改变了RG2 GSCs的免疫表型*MHC-I公司*(我),*MHC-II型*(j个),*肿瘤坏死因子-α*(k个)和CXCL10(我)表达，诱导CD8⁺淋巴细胞浸润(米)，导致肿瘤细胞凋亡(n个TUNEL染色）。标尺，50μm

图6
肿瘤宿主的免疫系统参与LPS预处理的抗肿瘤作用。一和b条：在野生型大鼠中，LPS预处理显著抑制皮下肿瘤生长。**c（c）**和d日：在裸鼠中，肿瘤均未生长(d日)也不是肿瘤的最终重量(d日)受到LPS预处理的显著影响。结果显示为平均值 ± 扫描电镜***P（P）* <0.01

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