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.2017年6月22日；8（6）：e2896。
doi:10.1038/cddis.2017.186。

TSPO在线粒体Ca中的作用2+体内平衡和氧化还原应激信号

杰玛·盖特利夫 1, 丹尼尔·A·东 1 2, 阿尔蒂·辛格 1, 玛丽亚·索莱达·阿尔瓦雷斯 1, 米歇尔·弗里森 1 三, 伊万娜·马蒂奇 4, 卡特琳娜·费雷纳 2 4, 娜塔莉·桑普森 5, 费德里科·特克海默 三, 米开朗基罗·坎帕内拉 1 4 6
附属公司

TSPO在线粒体Ca中的作用2+体内平衡和氧化还原应激信号

杰玛·盖特利夫等。 细胞死亡疾病. .

摘要

18kDa易位蛋白TSPO定位于线粒体外膜（OMM）。它在神经炎症部位系统性过度表达，被用作大脑状况的生物标志物。TSPO通过限制PARK2介导的线粒体泛素化，通过活性氧（ROS）的围生体积累抑制线粒体的自噬清除。这里我们描述了TSPO解除线粒体Ca的调控2+导致胞浆钙平行增加的信号2+激活Ca的池2+-依赖NADPH氧化酶（NOX）从而增加ROS。线粒体钙的抑制2+TSPO的摄取是电压依赖性阴离子通道（VDAC1）被蛋白激酶a（PKA）磷酸化的结果，蛋白激酶a被补充到线粒体，与含有3（ACBD3）的酰基-CoA结合域复合。值得注意的是，神经递质谷氨酸在年龄依赖性条件下导致神经元毒性，触发这种依赖TSPO的细胞信号机制，导致细胞死亡。因此，TSPO被认为是一种基于OMM的控制细胞内钙的新途径2+神经元细胞毒性的动力学和氧化还原瞬态。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
TSPO相关活性氧来源于钙2+-依赖性NADPH氧化酶。(一)Western blot显示TSPO在SH-SY5Y中过度表达。(b条)TSPO过度表达的量化。(c（c）)在KN93存在下，TSPO击倒SH-SY5Y细胞的代表性二氢乙锭（DHE）痕迹。(d日)显示二氢乙炔荧光强度平均增长率的相应条形图；n个=3（每个分析领域30个细胞）；P（P）<0.001. (e（电子）)显示用DPI（200）处理的+TSPO细胞中DHE荧光强度增加率的条形图 nM）。(如果)柱状图显示了用Apocynin（200 nM）。(克)Western blot显示SH-SY5Y细胞中TSPO敲除(n个=4，⩾每个分析领域50个细胞，P（P）<0.001); (小时)SH-SY5Y细胞TSPO表达的定量研究(n个=2，⩾每个分析领域50个细胞，P（P）<0.001). (我)显示−TSPO细胞DHE荧光强度增加率的条形图(n个=2，⩾每个分析领域50个细胞，P（P）<0.001). (j个)SH-SY5Y中NOX亚型的qRT-PCR研究(P（P）<0.001). (k个)对照组和NOX5 KD细胞中NOX表达的qRT-PCR研究显示基因表达的折叠变化(n个=3,P（P）<0.001). (我)显示NOX5 KD细胞中DHE荧光强度增加率的条形图(n个=3，⩾每个分析领域40个细胞，P（P）>0.05; **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001)
图2
图2
TSPO重塑细胞钙2+哺乳动物细胞中的信号。(一)代表性Ca2+转染mtAeq并受ATP刺激的MEF的瞬态（1 μM） ●●●●。(b条)显示平均最大值[Ca的图表2+]米 n个=5; ⩾每个分析领域50个细胞；P（P）<0.05. (c（c）)代表性Ca2+转染cytAq并受ATP刺激的MEF的瞬态（1 mM）。(d日)显示平均最大值[Ca的图表2+]c（c） n个=3；⩾每个分析场50个细胞；P（P）<0.05. (e（电子）)代表性线粒体Ca2+在装载Rhod-2并用Thapsigargin（100）刺激的MEF中获得的痕迹 nM）。(如果)显示MEF中平均最大Rhod-2荧光强度的图表。n个=4; ⩾每个分析领域40个细胞；P（P）<0.001. (克)代表性胞浆钙2+在装载Fluo-4并用Thapsigargin（100）刺激的CF35细胞中获得的微量 nM）。(小时)显示MEF中Fluo-4平均最大荧光强度的图表(n个=3; ⩾每个分析领域40个细胞；P（P）<0.001). (我)Thapsigargin处理的对照组和TSPO-KD细胞之间DHE荧光的平均强度(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001)
图3
图3
TSPO改变线粒体网络形态，但不改变ER线粒体连接。(一)通过共焦显微镜获得的细胞线粒体网络的代表性中间平面横截面图像如左图所示。白色方框显示单元格区域，然后在右侧面板中放大。(b条)根据TSPO表达显示线粒体平均长宽比的条形图(n个>15个细胞；P（P）<0.001). (c（c）)根据TSPO表达显示线粒体平均形状因子的条形图；n个>15个细胞；P（P）<0.001. (d日)显示ER-mitochondria邻近的电镜照片(e（电子）)代表性共焦图像，绿色信号表示ER-绿色，红色信号表示线粒体网络。与ER重叠的线粒体区域为黄色。(如果)曼德斯系数M1，以与线粒体接触的内质网体积/内质网总体积计算；n个>5个细胞；P（P）>0.05. (克)显示Manders系数M2（通过与ER接触的线粒体体积/线粒体总体积计算）如何根据TSPO表达而变化的图表。图表显示与内质网相连的线粒体百分比；n个>5个细胞；P（P）>0.05. (小时)展板描述了以替代量表达TSPO的SH-SY5Y细胞中有丝分裂抑制的有丝分裂原测定。(我)量化以有丝分裂原荧光比率表示的有丝分裂指数(*P（P）<0.05, ***P（P）<0.001)
图4
图4
TSPO依赖性Ca2+调节发生在OMM并且需要VDAC1和PKA。(一)实时qRT-PCR研究显示MCU的mRNA水平，标准化为MEFs中的VDAC水平；n个=3;P（P）>0.05. (b条)实时qRT-PCR研究显示MCU的mRNA水平，归一化为MEF中的VDAC水平，MCU表达受到调节；n个=7; ***P（P）<0.001. (c（c）)实时qRT-PCR研究显示TSPO的mRNA水平，归一化为MEF中VDAC水平，MCU表达受到调节，n个=5. (d日和e（电子）)MEFs WT中MCU的免疫印迹和定量敲除基因e（电子）. (如果)显示ATP诱导线粒体Ca的代表性痕迹2+MEF中的吸收。(克)显示平均最大值[Ca的图表2+]米响应ATP（1 mM）在MEF中(n个=3; ***P（P）<0.001). (小时)显示ATP诱导钙的代表性痕迹2+TSPO-silenced VDAC1中的瞬态−/−MEF公司。(我)显示平均最大值[Ca的条形图2+]米在VDAC1中−/−MEF；n个=4; **P（P）<0.05. (j个)显示ATP诱导钙的代表性痕迹2+暴露于PKI的瞬态MEF
图5
图5
TSPO将ACBD3和PKA招募到线粒体并调节VDAC1磷酸化。(一)线粒体免疫印迹和(b条)对照组和+TSPO MEF的细胞溶质提取物与右侧显示的抗体重复运行。(c（c）)显示线粒体部分ACBD3、PKA、TSPO归一化为ATPB5的平均带密度的条形图(n个=4）和(d日)细胞溶质组分中ACBD3、PKA归一化为ACTB。(e（电子）)SH-TSPOkd线粒体ACBD3和PKA的免疫印迹分析。(如果)线粒体部分ACBD3、PKA、TSPO归一化为SDHA(n个=4). (克)TSPO调节条件下SH-SY5Y细胞中VDAC的免疫沉淀。下部（输入5%）用VDAC1和TSPO抗体进行免疫印迹。印迹（IP）的上部显示磷酸化VDAC1。(小时)显示平均带密度的条形图α-根据TSPO表达的磷酸丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸，标准化为输入VDAC1(n个=3*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001)
图6
图6
谷氨酸诱导的应激反应上调TSPO在线粒体上招募ACBD3–PKA复合物(一)在1、4、12和18个月的不同时间点，小鼠脑裂解物中TSPO的表达水平。(b条)数据量化(n个=2). (c（c）)显示对照组、非沉默对照组和经谷氨酸处理的TSPO调制细胞中DHE荧光强度增加率的条形图（4 mM，急性；⩾每个分析领域15个细胞，P（P）<0.01). (d日)显示VDAC或TSPO调制细胞或PKI处理细胞中谷氨酸诱导细胞死亡的条形图(n个=4,P（P）<0.05). (e（电子）)经谷氨酸处理的SH-SY5Y线粒体和细胞溶质部分的代表性免疫印迹。抗体显示在右侧。(如果)条形图显示了在谷氨酸处理期间TSPO、ACBD3和PKA线粒体分布的带密度变化，归一化为ATPB5。(克)U0126联合治疗期间谷氨酸激发神经元线粒体和细胞溶质部分的代表性免疫印迹。(小时)报告蛋白质表达谱相对定量的条形图(*P（P）<0.05, **P（P）<0.01, ***P（P）<0.001)
图7
图7
TSPO介导线粒体Ca调节的工作机制2+处理。TSPO的过度表达导致ACBD3和PKA的招募，并对应于VDAC1磷酸化的增加。钙2+从内部储存中释放出来的物质积聚在胞浆中，无法通过VDAC1扩散到线粒体外膜。胞浆钙的增加2+通过CaMKII激活NOX5，从而改变REDOX平衡
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