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.2017年6月19日;18(1):122。
doi:10.1186/s12931-017-0606-x。

特发性肺纤维化(IPF)中成纤维细胞旁分泌TNF-α信号上调整合素A5的表达

附属公司

特发性肺纤维化(IPF)中成纤维细胞旁分泌TNF-α信号上调整合素A5的表达

加利·爱泼斯坦·肖切特等。 回复Res. .

摘要

背景:特发性肺纤维化(IPF)是一种进展性肺病,预后较差。炎症细胞因子在IPF病理学中起着重要作用。然而,成纤维细胞本身也被认为是IPF的主要效应器。我们假设成纤维细胞本身分泌促炎细胞因子,这些细胞因子可以通过影响正常邻近细胞来传播IPF。因此,我们探讨了IPF成纤维细胞衍生培养基对正常成纤维细胞特性的影响。

方法:建立原代IPF/正常组织来源的成纤维细胞培养物,并收集其上清液(分别为IPF/N-SN)。将这些上清液添加到正常成纤维细胞中。检测细胞死亡(caspase-3,western blot)、增殖、存活(WST-1)、迁移(划痕试验)和细胞脱落(结晶紫和纤维连接蛋白粘附试验)。采用ELISA定量芯片检测10种炎性细胞因子。western blot/IHC检测整合素α5(ITGA5)、pIκBα、p/总STAT3水平。使用抗TNF-α单克隆抗体英夫利昔单抗®证实了TNF-α的参与。

结果:IPF-SN促进成纤维细胞分离,减少细胞迁移(p<0.05)。然而,当细胞接种在纤维连接蛋白上时,这些作用被逆转。除了NFκB通路激活(pIκBα150%,p<0.05)。与此相一致,IPF衍生的成纤维细胞表达的ITGA5高于正常细胞(44%↑, p<0.05)。ITGA5也在成纤维细胞病灶中表达。IPF-SN含有较高的TNF-α水平(3倍,p<0.05),英夫利昔单抗预处理成功逆转了上述所有观察结果。

结论:我们提出了IPF成纤维细胞分泌TNF-α改变邻近成纤维细胞行为的可能机制。

关键词:成纤维细胞;特发性肺纤维化;整合素α5;肿瘤坏死因子-α。

PubMed免责声明

数字

图1
图1
IPF成纤维细胞衍生上清液以纤维连接蛋白依赖的方式影响正常成纤维细胞的迁移和分离。将IPF/正常上清液添加到接种在塑料或纤维连接蛋白(FN)(10μg/ml)涂层板上的成纤维细胞中30分钟(-b条)和24小时(e(电子)-(f)). 培养后,收获细胞进行蛋白质/RNA提取以及IPF衍生上清液(IPF-SN)对PCNA的影响()和半胱天冬酶-3(b条)用western印迹法检测水平(n个 = 4). 通过划痕试验测试IPF-SN对成纤维细胞迁移的影响(c(c)). 划痕试验后,用结晶紫染色定量细胞脱落(d日) (n个 = 9和n个 = 塑料和FN分别为4)。胶原蛋白1a(COL1A)(e(电子))和αSMA(ACTA2)((f))用qPCR检测mRNA水平(n个 = 4). 结果被归一化为对照,并被视为显著*如果第页 < 0.05,误差条代表标准误差
图2
图2
IPF成纤维细胞衍生上清液提高整合素α5(ITGA5)水平。将IPF/正常上清液添加到接种在塑料或纤维连接蛋白(FN)(10μg/ml)涂层板上的成纤维细胞中。培养后,收集细胞进行蛋白质提取,并测试其与FN的粘附性。通过western blotting分析ITGA5水平(n个 = 13) (). 通过显微镜下细胞计数定量细胞与FN的粘附(n个 = 5) (b条). 将结果归一化为对照(N-SN),如果第页 < 0.05(n ≥ 4) ,误差栏表示标准误差。(c(c))IPF-SN培养的成纤维细胞FN粘附增加的典型显微照片(正确的)24小时后
图3
图3
IPF衍生的成纤维细胞表达较高水平的整合素a5(ITGA5)。在整个组织裂解液中测量ITGA5水平()和IPF/正常来源的成纤维细胞(b条)通过免疫印迹法。(n个 = 7和n个 = 正常和IPF分别为6)。如果第页 < 0.05
图4
图4
IPF成纤维细胞灶表达整合素a5(ITGA5)。正常(-b条)和IPF(c(c)-)肺组织标本用甲醛固定,石蜡包埋。脱蜡后,玻片用苏木精和伊红染色(c(c)),Masson三色染色(d日),IgG兔同种型对照(e(电子))和抗ITGA5抗体(-b条(f)-). FF公司 = 成纤维细胞灶;AM-肺泡巨噬细胞;欧盟委员会 = 内皮细胞
图5
图5
TNF-α介导ITGA5升高和NF-κB通路激活。将IPF/正常上清液添加到接种在塑料或纤维连接蛋白(FN)(10μg/ml)涂层板上的成纤维细胞中30分钟。培养后,收集细胞进行蛋白质提取,并观察IPF衍生上清液(IPF-SN)对pIκBα的影响()以及pSTAT3-Tyr705和pSTAT3-ser727(b条)用western印迹法检测水平(n个 = 4). 将英夫利昔单抗(200–400μg/ml)添加到与正常(N-SN)/IPF-SN培养的成纤维细胞中。24小时后通过western blotting分析ITGA5的水平(n个 = 8和n个 = 200和400μg/ml分别为4)(c(c))和pIκBα(n个 = 4) (d日)和pSTAT3-Tyr705(n个 = 4) (e(电子))30分钟后。将结果归一化为对照(N-SN),如果第页 < 0.05,误差条代表标准误差
图6
图6
TNF-α阻断逆转IPF分泌因子的作用。将英夫利昔单抗(100–400μg/ml)添加到用正常(N-SN)/IPF(IPF-SN)上清液培养的成纤维细胞中,并测试其对细胞粘附纤维连接蛋白(FN)的影响(n个 = 5) (). 将含有或不含英夫利昔单抗(400μg/ml)的IPF/正常上清液添加到接种在塑料或纤维连接蛋白(FN)(10μg/ml)涂层板上的成纤维细胞中,并测试细胞迁移(n个 = 4) (b条). 将结果归一化为对照(N-SN),如果第页 < 0.05,误差条代表标准误差。划痕试验分析的代表性显微照片(c(c)). 将IPF/正常上清液加入接种在塑料或FN(10μg/ml)涂层板上的成纤维细胞中30分钟。PCNA公司(n个 = 4) western blotting检测caspase-3水平。4个独立实验的代表图(d日)

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