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.2017年6月15日；13（6）：e1006404。
doi:10.1371/journal.ppat.1006404。 eCollection 2017年6月。

低氧诱导因子-1α通过直接结合BZLF1基因启动子诱导裂解感染，在EB病毒的自然生命周期和肿瘤发生中发挥作用

理查德·克劳斯 1, 余贤明 1, 蓝色叶子A绳 1, Saraniya Sathiamoorthi公司 1, 塔文·伊恩普里德 2, 达南杰·M·纳万达 1, 马士东 1, 詹姆斯·罗梅罗-大师 1, 凯尔·麦切斯尼 1, 甄琳 3, 凯瑟琳·马基尔斯基 1, 丹尼斯·L·李 1, 保罗·F·兰伯特 1, 埃里克·C·约翰森 1 4, 香农·C·肯尼 1 4, 珍妮特·默茨 1
附属公司

低氧诱导因子-1α通过直接结合BZLF1基因启动子诱导裂解感染，在EB病毒的自然生命周期和肿瘤发生中发挥作用

理查德·J·克劳斯等。 公共科学图书馆-病理学. .

摘要

当面临缺氧时，细胞通过激活生存信号通路进行适应，包括被称为缺氧诱导因子α（HIF-αs）的氧敏感转录调节因子。我们在此报告HIF-1α也调节EB病毒（EBV）的生命周期。将EBV阳性胃癌AGS-Akata和SNU-719以及Burkitt淋巴瘤Sal和KemIII细胞系与脯氨酰羟化酶抑制剂L-mimosine或去铁胺或NEDD化抑制剂MLN4924孵育，促进HIF-1α和裂解EBV抗原的快速持续积累。ShRNA敲除HIF-1α显著降低去铁胺介导的溶血再激活。HIF-1α直接结合EBV初级潜伏开关BZLF1基因的启动子Zp，通过位于nt-83到-76的一致性低氧反应元件（HRE）激活转录，该元件位于转录起始位点。HIF-1α没有激活另一个EBV早期基因BRLF1的转录。重要的是，HIF-1α的表达在携带野生型EBV的细胞中诱导了EBV-lytic-gene的表达，但在感染该HRE内含有碱基对替换突变的变体的细胞中没有诱导。人类口腔角质形成细胞（NOK）和牙龈上皮（hGET）细胞通过与甲基纤维素孵育或在器官型培养基中生长诱导分化，积累HIF-1α和Blimp-1α，这是另一种与溶血再激活有关的细胞因子。在B细胞分化为浆细胞的过程中，HIF-1α活性也与Blimp-1α一起积累。此外，在EBV诱导的NSG小鼠淋巴瘤中观察到的具有人源化免疫系统的大多数BZLF1表达细胞位于肿瘤缺氧区域的血管远端。因此，我们得出结论，HIF-1α在EBV的自然生命周期和EBV相关肿瘤发生中起着核心作用。我们认为，诱导HIF-1α蛋白积聚的药物是开发用于治疗某些EBV相关恶性肿瘤的溶血诱导疗法的良好候选药物。

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利益冲突声明

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数字

图1
图1。缺氧模拟物诱导一些EBV中裂解EBV蛋白的积累+细胞系。
（A） ）免疫印迹显示HIF-1α和Zta在Sal细胞与指示浓度的L-含羞草碱孵育24小时后积聚。（B）免疫印记显示HIF-α的相对水平以及添加DFO培养基24小时后AGS-Akata和SNU-719细胞中存在的指示裂解EBV抗原（200μM；第2和第5道），MLN4924（5μM；车道3和6）或稀释液车辆（车道1和4）。（C） 免疫印迹显示HIF-1α和EBV编码蛋白Zta、EAD和VCA/p18在含有（+）或不含（-）200μM DFO的AGS-Akata细胞孵育24小时后积累，然后立即收获（1道和2道）或收获前在没有DFO的情况下再培养24小时（3道和4道）。（D） 免疫印迹显示在存在（+）或不存在（-）200μM DFO的情况下培养24小时的多个细胞系中指示蛋白质的相对积累水平。（E）如面板D所述，比较培养后Sal细胞和KemIII细胞中HIF-1α和Zta的积累的免疫印迹。制备全细胞提取物，加工，并探测指示的蛋白质。GAPDH起到了装载控制的作用。所示数据代表了许多独立的实验集。
图2
图2。双重免疫荧光染色表明DFO在表达HIF-1α的EBV阳性细胞亚群中有效诱导Zta蛋白的合成。
在固定和处理之前，将生长在盖玻片上的AGS-Akata细胞在没有（-）或存在（+）200μM DFO的情况下培养24小时，以通过IFS共同检测蛋白质Zta（绿色）和HIF-1α（红色）。用绿色结合二级抗体（不含一级抗体）独立检测DFO处理的细胞，以控制病毒编码的背景GFP。
图3
图3。HIF-1α的添加足以诱导EBV活化，并且对于DFO的有效诱导是必要的。
（A） 免疫印迹显示添加HIF-1α足以诱导裂解EBV重新激活。用1μg pHA-HIF-1αP402A/P564A-pcDNA3加pHIF-β（+）或2μg其空载体pcDNA3作为对照（-）转染在10cm培养皿中生长的AGS Akata细胞，并在制备全细胞提取物之前孵育48小时。数据是众多独立实验的代表。（B） 免疫印迹显示HIF-1α的敲除抑制DFO诱导的EBV裂解抗原的合成。在10-cm培养皿中保存的AGS-Akata细胞1-6区，与五种慢病毒中的每一种共转染0.8μg，这些慢病毒表达靶向HIF-1α的不同shRNAs（5-6区）或表达非靶向shRNA-cntl的4μg慢病毒#1或cntl#2（分别为1-2车道和3-4车道）。两天后，在采集和制备全细胞提取物之前，在没有（-）或存在（+）200μM DFO的情况下培养细胞24小时。7-10道，Sal细胞感染了指示的包装慢病毒；三天后，在没有（-）或存在（+）200μM DFO的情况下培养细胞24小时，并进行同样的处理。数据是两个独立实验的代表。GADPH用作加载控制。
图4
图4。HIF-1α诱导Zp转录激活，但不诱导Rp转录激活。
将保存在24孔板中的293T细胞与（i）含有HSV TK基因（pTATA-luc）nt-30至+30区域（作为对照）、Zp的nt-221至+30区（pWTZp-luc）或Rp的nt-1069至+38区域（pWTRp-lucpHA-HIF-1αP402A/P564A-pcDNA3加上pHIF-1β（各40 ng），pcDNA3-BRLF1（30 ng）作为阳性对照，pcDNA4（80 ng）作为阴性对照。48小时后采集细胞，测定荧光素酶活性。将每个报告人获得的数据归一化为与pcDNA3共转染时获得的值；它们是三个独立实验的平均值，每个实验进行三次；误差条表示平均值的标准误差。**，第页< 0.01.
图5
图5。Zp包含由HIF-1α和HIF-2α激活的转录功能HRE。
（A）生物信息学鉴定与Zp转录起始位点相关的从nt-83到-76的共有HRE。此处所示为示意图顺式-作用调节元件（用矩形表示）及其反式-已知的作用因素。SBE、SMAD结合元件。（B） 这里分析的示意图显示了碱基对替换突变体M1-M4和ZIIRM中存在的序列改变。序列上方的行指示HRE、ZIIR和ZII元素的位置。（C，D）从Zp到推定HRE的转录的HIF-1α和HIF-2α依赖性激活。将保存在24孔板中的293T细胞与（i）200 ng pTATA-luc作为对照，pWTZp-luc或图5B中所示的pWTZp-luc的碱基对替换变体，以及（ii）pHA-HIF-1αP402A/P564A-pcDNA3（面板C）或pHA-HIL-2αP405A/P531A-pcDNA4（面板D）加上pHIF-1β（每个40 ng）或80 ng pcDNA3。48小时后采集细胞，按照图4图例所述测定荧光素酶活性。数据是三个或三个以上独立实验的平均值，每个实验一式三份。**，第页< 0.01.
图6
图6。HIF-1α序列特异性结合nt-80区Zp-HRE。
（A） EMSA显示HIF-1α与放射性标记的双链寡核苷酸结合，该寡核苷酸包含面板C中显示的一致HRE WT序列。从CoCl制备的核提取物中获得约30μg蛋白质2–在添加探针DNA和电泳之前，将处理过的AGS细胞与1μg抗HIF-1α多克隆抗体（第2道）或1μg抗体作为对照（第1道）预先孵育。（B） 竞争EMSA显示HIF-1α与Zp HRE的序列特异性结合。在添加放射性标记探针和电泳之前，通过将反应混合物与指定数量的未标记的双链竞争性寡核苷酸进行预培养来进行分析。（C） 用作探针（HRE-WT）和竞争物的寡核苷酸序列。斜体字表示碱基突变。框，HRE。
图7
图7。HIF-1α在整个EBV基因组中与Zp结合。
（A） 在处理ChIP分析之前，免疫印迹显示Sal和SNU-719细胞中HIF-1α和Zta的相对水平，在有（+）或无（-）200μM DFO的情况下培养24小时。（B，C）用抗HIF-1α或抗IgG抗体沉淀后从A组细胞中获得的染色质的定量PCR分析。引物对跨越Zp与位于Zp上游4.8-kbp的序列作为阴性对照（neg.cntl.）。给出的数据是两个独立实验的平均Ct值，每个实验一式三份；误差条表示标准偏差。**，第页< 0.01; ***,第页< 0.001.
图8
图8。HIF-α诱导的EBV裂解再激活需要Zp-HRE。
将6孔板中生长的WT和HRE突变感染的293T细胞系转染为均匀条带（+）：（A）表达HIF-1β和HIF-1α氧敏感性变体的质粒各0.5μg；（B） 50ng的Zta表达质粒pCMV-BZLF1；（C） 100 ng Rta-表达质粒pRTS15；或（D）表达HIF-1β和HIF-2α氧敏感性变体的质粒各0.5μg。72小时后制备全细胞提取物，并通过免疫印迹分析所示蛋白。相应地，在奇数车道（-）中平行转染相同数量的pcDNA3 DNA作为对照。
图9
图9。记忆B细胞分化为血浆消融剂可诱导HIF-1α活性。
人原代B细胞分化为某些细胞基因浆细胞过程中RNA水平的变化(VEGFA（血管内皮生长因子）,PDK1系列)已知其表达被HIF-1α和其他一些基因激活，其产物（ZEB1、ZEB2、Blimp-1α、XBP-1s）已知有助于调节BZLF1型基因表达。这些RNA的相对水平是通过提取五组微阵列分析数据来确定的，这些微阵列分析是从八个指示的B细胞分化阶段采集的细胞中纯化的mRNA。请注意y轴显示的比例差异很大。
图10
图10。上皮细胞分化诱导HIF-1α的积累。
免疫印迹显示，在甲基纤维素（K-SFM中1.6%）悬浮液诱导（A）NOK和（B）NOK-Akata细胞分化后，HIF-1α蛋白水平随时间变化。（C） 免疫印迹显示，甲基纤维素悬浮液诱导分化后，hGET细胞中HIF-1α积聚（K-SFM中1.6%，48小时；通道2）。作为对照，在不含MC的K-SFM中平行培养第1、3和4通道的细胞。对于第4通道，在收获前24小时向细胞中添加50μM DFO，作为不含MC诱导分化的HIF-1α稳定的对照。（D） 免疫印迹显示，通过在气-液界面的器官型培养中生长11天诱导分化后，NOK（克隆#3）细胞中HIF-1α积聚。通道2-4含有三种不同筏的蛋白质提取物。通道1包含来自NOK（克隆#1）细胞的蛋白质提取物，该细胞在K-SFM中作为单层生长而保持未分化状态。制备全细胞提取物并分析所示蛋白质。
图11
图11。大多数Zta+EBV诱导小鼠B细胞淋巴瘤中存在的细胞具有人源化免疫系统，位于血管远端。
将1.5小时前感染M81株EBV的人脐血静脉注射给NSG小鼠。33天后，处死小鼠，将肿瘤快速冷冻、切片，并用IFS处理所示蛋白。（A） 切片共染EBNA2（绿色）和CD31（红色）。（B） 切片共染Zta（绿色）和CD31（红色）。（C） 切片共染Zta（绿色）和Hypoxyprobe（红色）。所有切片均用DAPI（蓝色）复染。这些部分代表了用二十多个EBV观察到的数据+用不同献血者的血液进行的几项实验中获得的肿瘤。箭头根据与CD31抗体的交叉激活来指示某些血管的位置。
图12
图12。显示EBNA2距离分布的直方图+与Zta相比+来自最近血管的细胞(我.e（电子）.，CD31+单元格）。
263 EBNA2的距离+和263 Zta+从染色切片上测量细胞，染色切片类似于图11和图S3所示。
图13
图13。上皮细胞和B细胞分化如何诱导EBV重新激活为裂解感染，以及通过改变已知有助于抑制和激活EBV的细胞转录因子水平影响EBV感染能力的模型BZLF1型和BRLF1型基因表达。
详见正文。
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