Regulated Erlin-dependent release of the B12 transmembrane J-protein promotes ER membrane penetration of a non-enveloped virus

doi:10.1371/journal.ppat.1006439

.2017年6月14日；13（6）：e1006439。

doi:10.1371/journal.ppat.1006439。 eCollection 2017年6月。

B12跨膜J蛋白的调节性Erlin依赖性释放促进非包膜病毒的ER膜渗透

井上孝文¹, 蔡比利（Billy Tsai）¹

附属公司

PMID： 28614383
预防性维修识别码：项目编号：5484543
内政部： 10.1371/日志.ppat.1006439

B12跨膜J蛋白的调节性Erlin依赖性释放促进非包膜病毒的ER膜渗透

井上孝文等。公共科学图书馆-病理学. 2017.

.2017年6月14日；13（6）：e1006439。

doi:10.1371/journal.ppat.1006439。 eCollection 2017年6月。

作者

井上孝文¹, 蔡比利（Billy Tsai）¹

附属

¹密歇根大学医学院细胞与发育生物学系，密歇根州安娜堡，美利坚合众国。

PMID： 28614383
预防性维修识别码：项目编号：5484543
内政部： 10.1371/日志.ppat.1006439

摘要

非包膜病毒穿透生物膜的分子机制仍然是个谜。无包膜多瘤病毒SV40穿透内质网（ER）膜到达胞浆并引起感染。我们之前证明，SV40通过动员选择的跨膜蛋白到内质网膜上的不同点（称为病灶）来创建自己的膜穿透结构，该点可能起到细胞溶质进入位点的作用。这些ER膜蛋白如何重组成病灶尚不清楚。B12是一种跨膜J蛋白，可动员进入病灶，促进SV40的胞浆进入。在这里，我们确定了两个密切相关的ER膜蛋白Erlin1和Erlin2（Erlin1/2）作为B12相互作用的伙伴。引人注目的是，SV40通过诱导Erlin1/2释放这种J蛋白，向病灶招募B12。因此，我们的数据揭示了非包膜病毒如何通过触发关键转运因子的释放和向膜渗透位点的募集来促进其自身的膜移位。

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利益冲突声明

提交人声明，不存在相互竞争的利益。

数字

**图1。B12与ER膜蛋白Erlin1和Erlin2结合。**
（A）对293 T-REx细胞和稳定表达3xFLAG-B12的细胞系中的亲代Flp-In进行裂解，并对所得的全细胞提取物进行SDS-PAGE，然后用B12抗体进行免疫印迹。（B）用于识别B12互动伙伴的策略。（C）将来自所示细胞系的细胞裂解物进行亲和纯化，如B所示，并用SDS-PAGE分析沉淀物质，然后进行银染色。（D）对来自所示细胞系的细胞裂解物进行FLAG免疫沉淀，沉淀样品用SDS样品缓冲液洗脱，并用所示抗体进行免疫印迹分析。

**图2。Erlin1和Erlin2在SV40感染期间执行关键功能。**
（A）用指示的siRNAs转染CV-1细胞，用洋地黄素进行分离，所得膜组分进行SDS-PAGE，然后用指示的抗体进行免疫印迹。（B）反转录-PCR（RT-PCR）分析来自转染有所示siRNA或经DTT处理的CV-1细胞的XBP1 mRNA的未切割（u）和剪接（s）形式。（C）在转染有指定siRNA的SV40感染的CV-1细胞中，对大的T抗原阳性细胞核进行评分。数据根据加扰的siRNA进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。（D）最初用打乱或PAN-Erlin siRNA转染的CV-1细胞随后用GFP-FLAG、Erlin1*-FLAG或Erlin2*-FLAG转染。然后用SV40感染细胞24小时，并使用FLAG抗体和大T抗原进行免疫荧光分析。只有表达所示FLAG蛋白的细胞才能对大T抗原表达进行评分。数据针对最初用扰乱的siRNA转染并随后用GFP-FLAG转染的细胞进行标准化，并代表来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。

**图3。Erlin1和Erlin2支持SV40 ER到胞浆的转运和病毒诱导的病灶形成。**
（A）将转染有所示siRNA的CV-1细胞用SV40感染12 h，收获后用洋地黄素处理并离心。用SDS-PAGE分析产生的含有胞质蛋白（胞浆）的上清液部分和含有膜细胞器（膜）的颗粒部分，然后用所示抗体进行免疫印迹。（B）使用ImageJ（NIH）定量A细胞溶质部分的VP1带强度。将数据与用干扰siRNA转染的细胞进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。（C） A中的膜部分用Triton X-100进一步溶解并离心。使用所示抗体通过免疫印迹法分析产生的含有ER-localized SV40的上清液部分（Triton X-100可溶性膜）。（D）用SV40感染转染了打乱或PAN-Erlin siRNA的CV-1细胞12小时，并使用洋地黄素进行分离，如在a中一样。用Triton X-100进一步溶解膜部分，并像在C中一样离心。用所示抗体通过免疫印迹法分析产生的上清液部分。（E）使用ImageJ（NIH）定量C和D中用打乱或PAN-Erlin siRNA转染细胞中ER-localized SV40的VP1带强度。数据针对用扰乱的siRNA转染的细胞进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。（F）用打乱或PAN-Erlin siRNA转染CV-1细胞后，用SV40感染细胞8 h，固定，并用B12和BAP31抗体进行免疫荧光染色，用DAPI（4，6-二氨基-2-苯基吲哚）染色。通过外荧光显微镜拍摄图像。箭头表示SV40诱导的病灶。Bar表示10μm。（G）统计转染有指示siRNA的SV40感染细胞中至少有一个B12和BAP31双阳性病灶的细胞数量。将数据与转染干扰siRNA的细胞进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。

**图4。与Erlin1和Erlin2的相互作用对于B12动员进入病灶并支持感染至关重要。**
（A）图中使用的N末端FLAG标记的B12结构体示意图。野生型B12（B12[WT]）由375个氨基酸组成，具有三个结构域：J结构域（J，112–176 aa）、甘氨酸/苯丙氨酸丰富结构域（G/F，184–213 aa）和跨膜结构域（TM，244–264 aa）。Hsp70结合缺陷B12（B12[H138Q]）携带突变，其中138位的组氨酸变为谷氨酰胺。突变体B12（B12[1-355]）缺少C末端的最后20个氨基酸。（B）对转染有所示FLAG标记构建物的293T细胞进行裂解，并使用FLAG抗体结合琼脂糖珠对所得的全细胞裂解物进行免疫沉淀。用所示抗体通过免疫印迹法分析全细胞裂解物（输入）和免疫沉淀物质。（C）将转染有指示的FLAG标记构建物的CV-1细胞感染SV40 16 h，固定，并使用BAP31和FLAG抗体进行免疫荧光分析。通过落射荧光显微镜拍摄图像。插图显示了对应于所附白色方块的3倍放大图像。Bar表示10μm。（D）统计SV40感染细胞中至少有一个BAP31和FLAG双阳性病灶的细胞数，如图3E所示。根据转染FLAG-B12[WT]的细胞对数据进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。（E）对亲代和B12 CRISPR KO CV-1细胞进行裂解，并用所示抗体进行免疫印迹分析所得的全细胞裂解物。（F）用指示的FLAG标记构建物转染的父母和B12 CRISPR KO CV-1细胞感染SV40，并使用针对FLAG和大T抗原的抗体进行免疫荧光分析。如图2D所示，对FLAG和大T抗原双阳性细胞进行计数和分析。数据根据转染GFP-FLAG的亲代细胞进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。

**图5。Erlin1和Erlin2不会重组为SV40诱导的病灶结构。**
（A）用SV40感染CV-1细胞16 h，固定，并用BAP31和Erlin1抗体进行免疫荧光分析。通过落射荧光显微镜拍摄图像。插图显示了对应于所附白色方块的3倍放大图像。Bar表示10μm。（B）转染Erlin2*-FLAG的CV-1细胞被SV40感染16 h，除使用B12、BAP31和FLAG抗体外，分析结果与A相同。

**图6。SV40诱导Erlin1和Erlin2释放B12。**
（A）转染GFP-FLAG或Erlin2-FLAG的CV-1细胞在无或有BFA的情况下模拟感染或SV40感染16 h。然后收集细胞并进行裂解。使用FLAG抗体结合琼脂糖珠对所得的全细胞裂解物进行免疫沉淀，并使用所示抗体对免疫沉淀样品进行免疫印迹分析。（B）与A中一样，除了使用了Erlin1-FLAG。（C）与A中的情况一样，只是使用了一种针对TMUB1的抗体进行免疫印迹。（D）使用ImageJ（NIH）定量A中的免疫沉淀B12带强度。将数据与表达Erlin2-FLAG的模拟感染细胞进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。（E）与D组一样，除了B组的免疫沉淀B12条带强度被量化外。（F）与D中一样，除了C中免疫沉淀的TMUB1条带强度被量化。（G）用SDS-PAGE分析SV40（WT）和SV40（ΔVP3），然后用VP1和VP3抗体进行免疫印迹。（H）与A中一样，除了用Erlin2 FLAG转染的CV-1细胞被模拟感染、用SV40（WT）感染或用SV40（ΔVP3）感染16小时之外。使用ImageJ（NIH）量化A中免疫沉淀的B12条带强度，并显示在B12条带下方。

**图7。将B12捕获到Erlin2可以防止B12动员到SV40诱导的病灶并阻止感染。**
（A）描述本研究中使用的FKBP-FRB二聚体系的示意图。B12与Erlin1/2相互作用的C-末端的最后20个氨基酸用红色表示。虽然B12-FRB-s与Erlin2-FKBP-FLAG结合，但在没有raplog-1的SV40感染期间，B12-FRB-s预计会与Erlin2-FKBP-FLAG分离。然而，在SV40感染期间存在raplog-1时，由于FKBP-FRB二聚化，B12-FRB-S被Erlin2-FKBP-FLAG捕获。（B）转染有或不带有Erlin2-FKBP-FLAG的B12[WT]-FRB-S的B12 CRISPR KO细胞被SV40感染或模拟感染6 h，并在有或无rapalog-1的情况下进一步培养10 h，以及使用FLAG抗体结合琼脂糖珠对所得细胞裂解物进行免疫沉淀。免疫沉淀样品用所示抗体进行免疫印迹分析。（C）用共表达Erlin2-FKBP-FLAG和GFP-S、B12[WT]-S或B12[WT]-FRB-S的载体转染的亲代和B12 CRISPR KO细胞感染SV40 6 h，在没有或存在rapalog-1的情况下进一步孵育18 h，并使用抗S-tag和大T抗原的抗体进行免疫荧光分析。如图2C所示，对S-tag和大T抗原双阳性细胞进行计数和分析。在没有rapalog-1的情况下，根据共表达Erlin2-FKBP-FLAG和GFP-S的亲代细胞对数据进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。（D）用共表达Erlin2-FKBP-FLAG和B12[WT]-FRB-S的载体转染的B12 CRISPR KO细胞感染SV40 6 h，在无或有rapalog-1的情况下进一步培养10 h，并使用S-tag和BAP31抗体进行免疫荧光分析。通过外荧光显微镜拍摄图像。插图显示了对应于所附白框的3倍放大图像。条形表示10μm。（E）统计SV40感染细胞中至少有一个S-tag和BAP31双阳性病灶的细胞数量，这些细胞在没有或存在rapalog-1的情况下共同表达Erlin2-FKBP-FLAG和B12[WT]-S或B12[WT]-FRB-S。在没有rapalog-1的情况下，根据共表达Erlin2-FKBP-FLAG和B12[WT]-S的细胞对数据进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。

**图8。Erlin1和Erlin2复合体将B12锚定在ER中。**
（A）用打乱或PAN-Erlin siRNA转染的CV-1细胞被固定，并使用B12和BAP31抗体进行免疫荧光分析。通过外荧光显微镜拍摄图像。Bar表示10μm。（B）对细胞核中至少有五个B12阳性聚集物的细胞进行评分。数据表示至少3个独立实验数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计学显著性。（C）用打乱或PAN-Erlin siRNA转染的CV-1细胞感染SV40，固定，并使用B12抗体和大T抗原进行免疫荧光分析。大T抗原阳性核的分析如图2C所示，除了在转染PAN-siRNA的细胞中，计算了至少显示五个B12阳性聚集物的细胞中大T抗原阳核的数量。对打乱和PAN Erlin siRNA转染细胞中的至少300个细胞核（总计）和显示B12阳性核聚集体的至少100个细胞核进行计数。数据根据用干扰siRNA转染的细胞进行标准化，并表示来自至少3个独立实验的数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。（D）用截短CMV驱动的FLAG-B12[WT]或FLAG-B12[1-355]转染的细胞被固定，并使用FLAG抗体进行免疫荧光分析。细胞核中至少有五个B12阳性聚集物的细胞按A进行评分。数据表示至少3个独立实验数据的平均值±标准偏差。学生双尾t吨检验用于确定统计显著性。

**图9。模型描述了Erlin1/2-B12相互作用在SV40 ER膜渗透过程中的作用。**
Erlin1和Erlin2（Erlin1/2）复合体被鉴定为B12的结合伙伴。当SV40从细胞表面传输到ER时，它触发了Erlin1/2复合体中B12的释放（步骤1）。释放的B12又会移动到病灶（步骤2），B12通过招募胞浆萃取复合物[6,21]，将病毒喷射到胞浆中，从而促进SV40的ER-胞浆膜渗透。在缺乏Erlin1/2复合物的情况下，B12可能定位于细胞核，这表明Erlin1/2在内质网中起着锚定B12的作用。

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