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.2017年7月12日；37(28):6729-6740.
doi:10.1523/JNEUROSCI.3017-16.2017。 Epub 2017年6月12日。

Cdc25A是缺血性神经元死亡的关键介导物体外试验和在体内

格雷斯·奥伊里希亚罗 1, 斗顺我 1, 瓦萨蒙·布恩英 1, 史蒂夫·卡拉汉 1, Matthew J期间 2, 露丝·S·斯拉克 1, 大卫·S·帕克 三
附属公司

Cdc25A是缺血性神经元死亡的关键介导物体外试验和在体内

格雷斯·奥伊里希亚罗等。 神经科学. .

摘要

细胞周期机制的失调与许多神经元死亡相关，包括中风。越来越多的证据表明，在缺血应激条件下，成熟神经元中的细胞周期素依赖性激酶（Cdks）被不当激活。我们之前证明了细胞周期蛋白D1/Cdk4/pRb（视网膜母细胞瘤抑癌蛋白）通路在缺血诱导的迟发性神经元死亡中的功能作用。然而，导致细胞周期蛋白D/Cdk4/pRb在缺血损伤后激活的分子信号目前尚不清楚。在此，我们研究了细胞分裂周期25（Cdc25）双特异性磷酸酶作为缺血性神经元死亡和Cdk4激活的潜在上游调节因子。我们发现Cdc25家族成员（a、B和C）的药理学抑制剂可以保护小鼠初级神经元免受缺氧诱导的延迟死亡。导致死亡过程的主要因素似乎是Cdc25A。shRNA介导的Cdc25A敲低在缺氧诱导的延迟死亡模型中保护神经元在体外观察到类似的结果体内大鼠全脑缺血后。相反，Cdc25B/C单一或双重缺失的神经元没有显著的保护作用。我们表明Cdc25A活性上调，但不是水平上调在体外缺氧和全身缺血损伤后体内最后，我们发现靶向Cdc25A的shRNA阻断了Ser795 pRb磷酸化。总的来说，我们的结果表明Cdc25A在缺血介导的迟发性神经元死亡中发挥作用。重要性声明中风的一个主要挑战是寻找有效的神经保护策略来治疗脑缺血损伤。Cdc25家族成员A（Cdc25A）是一种磷酸酶，通常在增殖细胞分裂期间激活。我们发现Cdc25A在缺氧介导的缺血应激神经元中被激活在体外和大鼠全脑缺血体内我们表明，药物或基因抑制Cdc25A活性可保护神经元免于延迟死亡在体外和体内下调Cdc25A导致视网膜母细胞瘤抑癌蛋白（pRb）磷酸化降低。pRb磷酸化的增加以前与缺血性神经元死亡有关。我们的结果确定Cdc25A是治疗迟发性缺血性神经元死亡的神经保护策略的潜在靶点。

关键词：Cdc25；细胞周期；缺氧；缺血；神经元死亡；(打、击等的)一下。

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数字

图1。
图1。
低氧损伤后Cdc25A活性增加在体外.A–C，CGN培养物在MK801存在下缺氧。在指定的时间，收集细胞并进行Western blot分析，并用抗Cdc25A探针进行检测(N个=8个独立实验；A类)，抗Cdc25B(N个=5个独立实验；B类)和反Cdc25C(N个=5个独立实验；C类)抗体。D–F型，Cdc25A变化的密度测定(天)，Cdc25B(E类)和Cdc25C(F类)与无缺氧（NH）控制相关的蛋白质水平。G–I型，Cdc25A的磷酸酶活性(N个=4个独立实验；G公司)，Cdc25B(N个=4个独立实验；H（H）)和Cdc25C(N个=3个独立实验；我)在MK801存在下缺氧后进行。缺氧后，Cdc25被免疫沉淀，并使用pNPP作为底物进行磷酸酶测定。通过测量pNPP底物在OD 410时的释放来测定Cdc25活性。结果表示为无低氧对照±SEM上的褶皱变化*第页<0.05，与无缺氧控制相比具有统计学意义（单因素方差分析，其次是Dunn的多因素比较试验）。
图2。
图2。
用Cdc25磷酸酶抑制剂（NSC95397）治疗可保护神经元免受缺氧诱导的延迟细胞死亡。A类,B类，在CGN培养物中评估NSC95397的细胞毒性。A类,B类用不同浓度的NSC95397处理神经元，并用Hoechst染色固定(A类)，并对NSC95397处理CGN培养物24小时后的神经元存活率进行量化(B类).N个=3个独立实验**第页< 0.01, ***第页<0.005，与无药物对照组相比具有统计学意义。C类，用10μ米MK801持续4天，并评估神经元存活率。N个= 4.天,E类用不同浓度的NSC95397处理的CGN在MK801存在下缺氧18 h，然后再复氧1、2和4 d。天共聚焦显微镜图像显示缺氧24小时后未处理和NSC95397处理的神经元培养物。对照培养物未进行缺氧处理。神经元标记物MAP-2（绿色）和Hoechst染色（蓝色）染色。比例尺，30μm. E类，神经元在不使用药物或不同浓度的Cdc25抑制剂NSC95397的情况下进行治疗，并受到缺氧和MK801的影响。在缺氧后1、2和4天对神经元存活率进行量化。结果表示为对照±SEM的百分比*第页< 0.05, **第页< 0.01, ****第页<0.0001，与缺氧处理的神经元相比具有统计学意义，无药物对照（双向方差分析，随后进行Bonferroni检验）。N个≥ 3.
图3。
图3。
Cdc25A敲除可保护神经元免受缺氧诱导的延迟细胞死亡。A类,B类将表达shRNA的AAV感染到Cdc25A或对照shRNA，并在MK801存在下缺氧18 h。A类，缺氧24小时后表达shRNA和GFP的病毒感染CGN的共焦显微镜图像。神经元用Hoechst染色（蓝色）进行复染。比例尺，30μm。B类，用表达Cdc25A shRNA或对照shRNA的AAV感染的细胞缺氧后24小时神经元存活的定量。通过对活GFP评分来评估存活率+神经元超过总感染细胞。N个=3**第页<0.01，双尾学生的统计显著性t吨测试。C类Western blot分析显示，感染了表达shRNA至Cdc25A的AAV的培养CGN中Cdc25A被击倒。D–F型，Cdc25B（+/+，N个= 5; −/−,N个= 4;天)和Cdc25C（+/+，N个= 4; −/−,N个= 3;E类)对于Cdc25B和Cdc25C（+/+，N个= 5; −/−,N个= 3;F类)在缺氧条件下加上MK801A类24小时后评估生存率。通过细胞核完整性评估细胞活力。Cdc25B或Cdc25C缺乏或两者联合缺乏对神经元存活没有影响。G公司，NSC95397对Cdc25B和Cdc25C双敲除神经元存活的拯救。Cdc25BC野生型(N个=5）或双重缺陷(N个=3）神经元接受或不接受0.5μ米NSC95397和缺氧+MK801，如A类24小时后评估细胞存活率。结果表示为对照组±SEM的百分比。*表示第页<0.05***第页<0.005，双向方差分析，然后是Tukey的多重比较测试。H（H）大鼠CGN被表达对照shRNA、Cdc25B shRNA或Cdc25C shRNA的AAV感染并缺氧。24小时后评估神经存活率B类数据表示以生存率±SEM表示的一式三份实验。我，Western blot显示Cdc25B和Cdc25C敲除。对表达Cdc25B、Cdc25C或对照shRNA的大鼠海马裂解物进行Western blot分析，并用抗Cdc25B或抗Cdc256C抗体进行检测。肌动蛋白被用作加载控制。
图4。
图4。
Cdc25A敲除使CGN对缺氧和谷氨酸介导的兴奋性毒性死亡敏感。用不同浓度的Cdc25抑制剂NSC95397处理CGN培养物，并在没有MK801的情况下缺氧5h。在复氧1小时后评估神经存活率。N个= 3.A类,B类，用NSC95397处理的CGN受到50μ米短暂接触谷氨酸70分钟(A类)1小时后检查存活率(B类).N个= 3.C类,天，用表达Cdc25A shRNA的AAV或对照shRNA感染的CGN在没有MK801的情况下用缺氧处理，并评估存活率。N个＝3，第页=0.068（学生的t吨检验，双尾检验；C类)或短暂接触谷氨酸，N个= 3. *第页<0.05（学生的t吨检验，双尾检验；天). 抗GFP抗体免疫荧光染色和Hoechst染色后，通过细胞核完整性评估神经元存活。E–G公司，Cdc25B的CGN为空，N个= 4 (E类); Cdc25C:+/+，N个= 3; −/−,N个= 5;F类)或对于Cdc25B和Cdc25C，+/+，N=5和−/−，N=5*第页<0.5（学生的t吨测试，双尾；G公司)短暂谷氨酸处理70min，1h后评估存活率。Cdc25B和Cdc25C双失活的神经元对谷氨酸介导的兴奋毒性死亡具有抵抗力。H（H）Western blot分析显示Cdc25B和Cdc25C双敲除脑样本中的Cdc25A蛋白水平增加。我，Cdc25A蛋白质的密度测定，如所示H（H）,N个= 3, *第页<0.5（学生的t吨测试，双尾）。J型Western blot分析谷氨酸处理指定时间后的Cdc25A蛋白水平。K（K），Cdc25A蛋白水平的定量E类.N个= 3,第页=0.053（学生的t吨测试，单尾测试）。L（左）谷氨酸处理30分钟后，Cdc25A磷酸酶活性。N个= 3.
图5。
图5。
Cdc25A敲除可保护大鼠海马CA1神经元免受全脑缺血介导的延迟死亡。A类免疫组织化学图像显示，注射AAV表达shRNA的大鼠海马CA1神经元中GFP表达。B类、未注射和AAV shRNA注射假手术和4VO治疗大鼠海马CA1神经元的代表性苏木精和曙红染色切片。C类Western blot分析显示，向Cdc25A注射AAV shRNA的大鼠体内Cdc25A被击倒。评估了两种shRNAs；shRNA 2被选择用于体内研究。天，非病毒神经元中4VO 10分钟后4天存活CA1神经元的定量(N个在假手术和4VO中=3），ctrl-shRNA(N个分别为4和7，假手术和4VO），以及Cdc25A shRNA(N个分别为5和8，假手术和4VO）注射AAV的大鼠。数据表示为±SEM*第页<0.05，与4VO ctrl shRNA相比具有统计学意义（ANOVA，其次是Tukey的多对比试验）。
图6。
图6。
诱导Cdc25A活性体内全脑缺血后。A类，全脑缺血后Cdc25A蛋白水平的Western blot分析时间进程。B类，Cdc25A蛋白质水平的密度测定A类.N个= 4.C类，Cdc25A的磷酸酶活性是在大鼠全脑缺血后诱导的。大鼠接受假手术或10分钟4VO，然后再灌注12或24小时。对Cdc25A进行免疫沉淀，并使用pNPP作为底物进行磷酸酶分析。通过测量pNPP底物在OD 410时的释放来测定Cdc25活性。结果表示为假对照±SEM的折叠变化**第页<0.01（方差分析，然后是Tukey的多重比较测试）。N个≥ 6.
图7。
图7。
缺血损伤后pRb磷酸化的诱导。A类对用Cdc25A或对照shRNA处理的大鼠海马样品的核裂解物进行Western blot分析。大鼠经4VO处理10分钟，然后再灌注12或24小时。用抗pRb Ser795和抗Rb抗体检测blot。B类，Ser795磷酸化pRb的密度测定，如A类结果表示为pRb±SEM中的折叠变化*第页=0.038通过Mann-Whitney检验的统计显著性，N个≥ 3.C类，Cdc25A或对照shRNA处理后4VO处理的大鼠海马核提取物A类进行Western blot分析，并用抗E2F1或抗Lamin B1抗体进行检测。天，对用Cdc25B或对照shRNA处理的大鼠海马核裂解物进行Western blot分析，并按A类并用抗pRb Ser795和抗Rb抗体进行检测。E类Western blot分析暴露于谷氨酸的小鼠CGN培养物中pRb磷酸化。N个≥ 3.
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