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.2017年7月15日；199(2):547-558.
doi:10.4049/jimmunol.1700232。 Epub 2017年6月9日。

人类幼稚和记忆T细胞中长非编码RNA的分布

Charles F Spurlock第三 1, 古泽尔·沙吉努罗娃 1, 约翰·托斯伯格 1, 乔纳森·德海斯特 1, 纳撒尼尔·查普曼 1, 严国 2, 菲利普·S·克鲁克第三 三, 托马斯·马恩 4 5
附属机构

人类幼稚和记忆T细胞中长非编码RNA的分布

Charles F Spurlock第三等。 免疫学杂志. .

摘要

我们采用全基因组RNA测序来分析人类原始、中央记忆和效应记忆CD4中的mRNAs以及注释和新的长非编码RNA（lncRNAs）+T细胞。转录谱系特异性注释和新lncRNA的位点与基因组中的谱系特异蛋白编码基因相邻。血统特异性新lncRNA基因座是从血统特异的典型和超转录增强子转录而来的，不是多外显子的，因此更类似于增强子RNA。新的增强子相关lncRNA转录自IFNG公司该位点结合转录因子NF-κB，并增强NFκB与IFNG公司基因组位点。带注释的lncRNA、IFNG-AS1或其中一个的耗尽IFNG公司增强子相关lncRNA消除IFNG公司通过记忆T细胞表达，表明这些lncRNA具有生物学功能。

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披露

作者声明没有利益冲突。

数字

图1
图1
mRNAs和lncRNAs的细胞型特异性表达。(A类)左面板，mRNAs总数（GRCh38释放，总蛋白编码基因=19950），注释lncRNAs（GRCh38-释放，长非编码基因=15767）和新的lncRNA，在至少一个细胞谱系中通过从头组装检测到，平均FPKM>1；中间面板，T中不同RNA类别的平均表达水平N个，T型厘米和T相对长度单位细胞；右侧面板，T中指示RNA类的总表达水平N个，T型厘米和T相对长度单位细胞（N＝3）。(B类)经FDR校正后，火山图识别谱系特异性RNA类别，P<0.05。X轴表示指示的表达比率，log2，Y轴为P值，-log10. (C类)显示谱系特异性表达的mRNA、注释lncRNA和新lncRNA的总数（来自（B））。(D类)通过与hg38（N=3）对齐的全基因组RNA-seq确定人类CD4+T细胞表达的mRNAs的表达水平。比例尺与热图相邻。MSigDB对血统特异性mRNA（在热图中确定）的分析作为输入，MSigDB分析的输出显示了相应的P值。(E类)lncRNA表达的个体差异。四种带注释的lncRNA在FPKM中的表达水平如T所示N个，T型厘米和T相对长度单位从三名个体受试者中分离出的亚群。
图2
图2
共表达谱系特异性蛋白编码基因和注释lncRNA基因的基因组位置之间的关系。(A类)结果表示为谱系特异性mRNA基因的百分比(○, T型N个; □, T型厘米; Δ，T相对长度单位)在与谱系特异性注释lncRNA基因的指定距离（kb）内，与相对于总mRNA基因的谱系特异注释lncRNA基因共同表达。(B类)如（A）所示，但结果是相对于基因组中远离谱系特异性注释lncRNA基因的基因数量表达的。(C类)相对于相邻的共表达谱系特异性注释lncRNA基因，以反义或有义方向转录的共表达谱系特异性mRNA基因的百分比。(D类)编码谱系特异性mRNA的基因在基因组中富集，靠近谱系特异注释的lncRNA基因。y轴是总谱系特异性T的百分比N个，T型厘米和T相对长度单位mRNA（图1，热图）。x轴是编码谱系特异性mRNA的基因与编码谱系特异性注释lncRNA的最近基因之间的距离2分析，TN个; P=10−22，T型厘米; P=10−12，T型相对长度单位; P=10−14.
图3
图3
血统特异性新lncRNAs的发现。(A类)分层聚类显示人CD4+T表达的新型lncRNA的表达水平N个，T型厘米和T相对长度单位由全基因组RNA-seq确定的细胞与hg19对齐（N=3）。(B类)基因组中编码谱系特异性mRNAs和新lncRNAs的基因的共定域。左侧面板：与另一个谱系特异性蛋白编码基因的指示距离（kb）内的谱系特异蛋白编码基因百分比，右侧面板：与共同表达的谱系特异性新lncRNA-编码基因的指定距离（kbs）内的谱系特异蛋白码基因百分比。(C类)编码谱系特异性mRNA的基因在基因组中富集于谱系特异的新lncRNA位点附近。y轴是总谱系特异性T的百分比N个，T型厘米和T相对长度单位mRNA（图1，热图）。x轴是编码谱系特异性mRNA的基因与编码谱系特异性新lncRNA的最近位点之间的距离，P值由c决定2分析，TN个，P=10−21; T型厘米，P=10−14; 和T相对长度单位P=10−19.
图4
图4
谱系特异性lncRNAs和转录增强子之间的关系。(A类)Circosplot描绘了CD4原始典型增强子和超级增强子（紫色）以及CD4记忆典型增强器（橙色）和超级增强子（蓝色）在外环的全基因组位置（参考文献20）。内同心圆中黑色的条形图显示了原始（最外层）、中央记忆和效应记忆（最内层）细胞中的谱系特异性新lncRNA(B类)根据每个基因位点的谱系特异性新lncRNAs数量对谱系特异mRNAs进行排名。某些基因位点的等级在图表中注明。(C类)根据每个基因组位点的新lncRNAs数量，对血统特异性SE进行排名。(D类)根据每个基因组位点的新lncRNAs数量，对特定血统的TE进行排名。
图5
图5
新型lncRNA的基因组分布。(A类)转录独特新lncRNAs的基因组位点之间的距离。X轴根据与下一个新lncRNA位点的距离对新lncRNA位点进行排序，Y轴显示相邻lncRNA座位之间的实际距离（单位：bp）。(B类)转录多个新lncRNA的基因组“箱子”的特征。(C、 设计与工程)基因组文库选择性转录（C）T中多个新lncRNA的例子N个相对于TM（M），D）T厘米相对于TN个和T相对长度单位和（E）T相对长度单位相对于TN个和T厘米X轴显示新的lncRNA从其转录的基因组位置；线说明转录的新lncRNA的大小。Y轴是所示T细胞谱系之间的平均表达比率log2。(F类)转录新lncRNAs与T共定位的基因组文库N个和TM（M）典型和超转录增强子（摘自参考文献20）。我们认为基因组文库可能与增强子不完全重叠，因此我们进行了分析，以包括与增强器共定位的文库比例（0），以及如果我们在X轴的5'和3'方向将文库大小扩展5、10、15、20或30 kb，则与增强剂共定位的文库比例。Y轴是带T的箱子总数的比例N个或TM（M）增强剂。P值，-log10，由c确定2分析。(G公司)T内的箱子数量M（M）SE或TE（CD4MSE、CD4MTE）结构或TN个SE或TE结构。X轴如（F）所示，Y轴是带增强器的箱子数量。（H&I）使用“bins”作为定义列表重新分析RNA-seq数据。(H（H）)在FDR校正后，发现T中的bins过度表达（蓝线）或表达不足（棕色线）厘米和T相对长度单位细胞与T的比较N个细胞。(我)T中差异表达的bins表达水平厘米相对于TN个和T相对长度单位FDR修正后。Y轴是表达式比率，log2，X轴识别比；Tn=TN个/T型N个，Tcm=T厘米/T型N个，温度=T相对长度单位/T型N个.
图6
图6
新的lncRNAsIFNG公司轨迹。(A类)在原代和效应Th1、Th2和Th17细胞、原始CD4+T细胞和T细胞中，从IFNG-AS1到IL26的RNA-seq追踪跨越约300 kb厘米和T相对长度单位细胞。以下是通过从头组装确定的编码新lncRNA的基因组位点的位置，以及在CD4+T中确定的典型和超级增强子（分别为TE和SE）的基因组位置M（M）还显示了单元格（参考文献20）。(B类)RNA-seq结果的PCR验证标准化为GAPDH。每个新的lncRNA都是相对于IFNG公司转录起始位点，-表示p末端，+表示q末端，两个T之间的差异厘米和TN个或T相对长度单位和TN个有统计学意义，N=4，P<0.05。(C类)记忆性T细胞的JQ1治疗会消除RNA聚合酶II结合，但不会消除H3K27Ac跨细胞的结合如果轨迹。将指示浓度的JQ1添加到记忆性T细胞培养物中。用板结合抗CD3刺激细胞24小时，用ChIP测定H3K27-Ac（左面板）和RNA聚合酶II（右面板）的水平。为此，我们设计了一个平铺阵列。100对PCR引物以~3 kb的间隔设计，以跨越300 kbIFNG公司轨迹。数据表示为输入平均分数（n=3），P<0.05，方差分析。(D类)用JQ1或I-BET培养总记忆CD4+T细胞24小时，以从基因组位点置换含BRD的蛋白质。RNA被纯化，并显示IFNG公司基因座新lncRNAs，IFNG-R-#，由PCR测定。结果是相对于GAPDH的水平来表达的。治疗组与未治疗组相比，P<0.05（N=4）。(E类)JQ1或I-BET抑制IFNG-AS1和IFNG公司表达式。使用和不使用JQ1或I-BET处理总记忆CD4+T细胞24小时，并用抗CD3刺激额外24小时。通过PCR测定IFNG-AS1的三种独特亚型（指定为1、2、3（图6A）和IFNG的水平，并将其归一化为GAPDH的水平，*=P<0.05（N=4）。(F类)靶向IFNG-AS1或IFNG-R-49的单个siRNA转染到总记忆CD4+T细胞中，然后用抗CD3刺激24小时。在mRNA分析之前，通过荧光激活细胞分选分离转染细胞，或测量细胞内IFN-g水平。通过非配对T检验测定P值。误差线为平均值+/-S.D.*=p<0.05。
图7
图7
IFNG公司-相关的lncRNA结合NF-κB。(A和B)细胞在有或无JQ1的情况下培养（150 nM，4小时）并溶解。裂解后(A类)反T-bet和(B类)检测抗NF-κB、p65亚单位、免疫沉淀（IP）。通过PCR测定抗T-bet、抗NF-κB、p65亚单位和同种对照免疫沉淀物中每个IFNG-R-lncRNA的水平。结果表示为所示输入的分数IFNG公司-相关的新lncRNA相对于每个IFNG-R-lncRNA的总量。同种型对照免疫沉淀物中IFNG-R-相关lncRNA的水平可忽略不计，因此不包括在计算中。误差线是8个独立实验的标准差，*=P<0.05。(C类)如（B）所示，除ChIP分析外，还进行了NF-κB，p65与IFNG公司基因组位点。结果表示为相对于同型对照的输入分数。误差线是5个独立实验的S.D，*=P<0.05。(D类)从T中分离出染色质M（M）细胞在非离子洗涤剂中溶解并用核糖核酸酶处理10分钟，RT。染色质与甲醛交联并处理以进行ChIP分析。NF-κB，p65结合表示为输入分数，N=3，*=P<0.05，比较处理和未处理样品。(E类)RNA酶处理后，通过离心法将染色质颗粒化，收集上清液，并通过western blotting分析NF-κB蛋白。箭头表示NF-κB的p65亚单位。(F类)用靶向IFNG-R-49（+）或干扰对照siRNA（−）的siRNA转染细胞，并培养24小时。用多聚甲醛固定培养物，收集并处理培养物，以使用NF-κB，p65亚单位，抗体进行ChIP分析。Y轴显示NF-κB，p65亚基，在指示的IFNG公司基因组位点，X轴。
图8
图8
BACH2基因座的新lncRNA。(A类)T细胞BACH2基因的RNA序列分析N个，T型厘米和T相对长度单位细胞。已知TE和SE在CD4+T细胞总数中的位置显示在测序轨道下方（参考文献20）。BACH2的外显子-内含子结构是底线。(B类)通过从头组装发现的13个BACH2相关新lncRNA在T细胞中的表达水平N个，和T相对长度单位和T厘米表示为平均FPKM，N=3，*=P<0.05。(C类)PCR验证（B）中相对于T中GAPDH表达的结果N个和TM（M）细胞，N=4，*=P<0.05。(D类)T型N个用JQ1或I-BET培养细胞24小时，以从基因组位点置换含BRD的蛋白质。RNA被纯化，13个BACH2相关新lncRNA的水平通过PCR测定。结果是相对于GAPDH水平表达的。N=4，*=P<0.05。(E类)如（D）所示，除了BACH2 mRNA的水平是通过PCR测定的，并且是相对于GAPDH表达的。使用不成对的T检验来确定P值。误差线为平均值+/-S.D.*=p<0.05
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