跳到主页内容
美国国旗

美国政府的官方网站

点政府

gov意味着它是官方的。
联邦政府网站通常以.gov或.mil结尾。之前分享敏感信息,确保你在联邦政府政府网站。

Https系统

该站点是安全的。
这个https(https)://确保您连接到官方网站,并且您提供的任何信息都是加密的并安全传输。

访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
.2017年7月18日;8(29):46728-46744.
doi:10.18632/目标11856。

基因多态性将G蛋白偶联和膜相关雌激素受体GPER重组为一种促进基质和乳腺癌细胞间旁分泌信号传导的转录因子样分子

附属公司

基因多态性将G蛋白偶联和膜相关雌激素受体GPER重组为一种促进基质和乳腺癌细胞间旁分泌信号传导的转录因子样分子

马可·普波等。 Oncotarget公司. .

摘要

GPER是G蛋白偶联受体家族中的一种膜相关雌激素受体。对于乳腺癌,已广泛研究了GPER在促进癌细胞和癌相关成纤维细胞(CAF)对雌激素和其他激动剂的增殖和迁移方面的作用。有趣的是,先前在一个分离的乳腺CAF中发现GPER定位于细胞核。此外,这种核GPER被证明能结合癌相关靶基因的调控序列并诱导其表达。我们决定找出是什么导致GPER的核定位,这种现象有多普遍,其功能意义是什么。我们发现,通过预测的糖基化位点突变或用衣霉素进行药理学干预,干扰GPER的N-连接糖基化,会使GPER进入细胞核。通过对乳腺癌活检中的一小组CAF进行调查,我们发现一种相对常见的单核苷酸多态性与GPER的核定位有关,这种多态性导致带有氨基酸替代物P16L的GPER变体的表达。带有P16L的GPER未能被糖基化,可能是因为附近糖基化位点上的构象效应。GPER P16L对膜相关信号传导有缺陷,但其作用类似于雌激素刺激的转录因子。在CAFs中,它诱导促进癌细胞迁移的旁分泌因子的分泌。这增加了GPER P16L多态性可能是乳腺癌风险因素的可能性。

关键词:乳腺癌;癌相关成纤维细胞;核定位;单核苷酸多态性;肿瘤微环境。

PubMed免责声明

利益冲突声明

利益冲突

提交人声明他们没有利益冲突。

数字

图1
图1。抑制N-连接糖基化诱导GPER核聚集
A类GPER蛋白质结构示意图。天冬酰胺残基N25、N32和N44被预测为受体N末端部分的N-连接糖基化位点。B类用5μg/ml衣霉素处理或不处理24小时的SkBr3乳腺癌细胞内源性GPER的代表性免疫荧光显微照片,并用抗GPER抗体染色(绿色染色)。细胞核用DAPI(蓝色)染色。显示的图像代表了10个不同的随机字段。C类用shRNA或shGPER构建物转染24小时的SkBr3细胞的GPER免疫荧光显微图,或用shGPER与野生型GPER(GPER Rescue)或N-糖基化双突变体N25/32Q的shRNA-resistance GPER表达载体联合转染额外24小时的细胞。显示的图像代表了10个不同的随机字段。D类用转染的SkBr3乳腺癌细胞进行亚细胞分离实验的免疫印迹。对于这些实验,外源GPER被标记为FLAG。微管蛋白和组蛋白H3分别作为细胞质和核室的标记物和标准化。底部面板显示了密度分析,每个数据点代表三个独立实验的平均值±SD。在对各室标记物进行标准化后,用FLAG标记的野生型GPER(每一组均设为100%)将数值表示为各样品的%。
图2
图2。GPER的P16L多态性存在于CAFs_I并促进GPER在转染SkBr3细胞中的核定位
直接扩增子测序全球能源监管局1编码SkBr3乳腺癌细胞GPER N末端的部分A类.和CAFs_IB类注意,CAFs_I是导致蛋白质中P16L替代的变异T等位基因的纯合子。C类FLAG标记的野生型和P16L变异GPER在转染的SkBr3细胞中的亚细胞定位。所示的免疫荧光图像代表10个不同的随机场。D类用转染的SkBr3乳腺癌细胞进行亚细胞分离实验的免疫印迹。外源性GPER是FLAG标记的,内源性微管蛋白和组蛋白H3分别作为细胞质和核室的标记物和标准化。右边的面板显示了密度分析的结果,每个数据点代表三个独立实验的平均值±SD。在对各室标记物进行标准化后,用FLAG标记的野生型GPER(每一组均设为100%)将数值表示为各样品的%。
图3
图3。乳腺癌活检标本中的CAF和正常成纤维细胞P16L多态性均为杂合子
直接扩增子测序全球能源监管局1浸润性癌患者#1-5 CAF和正常成纤维细胞GPER N末端编码部分A类以及来自原位癌患者#6-8和独立正常上皮细胞的比较B类注意,这组样品中的所有成纤维细胞均显示双峰,C和T均位于相关位置(箭头)。C类分析PCR方案,以确认测序显示的C/T多态性的存在。使用两个常见的外引物(outer Fw和outer Rv)和两个等位基因特异的内引物(inner-C和inner-T),生成特定诊断大小的PCR产物。D类琼脂糖凝胶的图像,用于用面板C的PCR方案对所有样品进行基因分型。T和N分别代表肿瘤(CAFs)和正常成纤维细胞。请注意,#1-8患者的成纤维细胞是杂合的,CAFs_I纯合子是T等位基因变异的,来自无关乳腺癌样本的上皮细胞和SkBr3细胞是C等位基因纯合子。
图4
图4。GPER定位于浸润性乳腺癌活检CAFs A和正常成纤维细胞B的细胞质和细胞核中
样本来自浸润性乳腺癌患者#1-5。样品用抗GPER抗体(绿色)和DAPI(蓝色)染色,并用共焦显微镜进行分析。免疫荧光显微照片代表了10个不同的随机场。
图5
图5。原位乳腺癌活检中GPER定位于CAFs A和正常成纤维细胞B的细胞质和细胞核中
样本来自6-8号患者。C类无关乳腺癌样本CAFs_I和上皮细胞的免疫荧光染色。样品用抗GPER抗体(绿色)和DAPI(蓝色)染色,并用共焦显微镜进行分析。免疫荧光显微照片代表了10个不同的随机场。
图6
图6。定位于细胞核的GPER不能刺激MAPK信号,但可以被招募到其靶基因的启动子c-FOS公司CTGF公司
A类免疫印迹显示ERK1/2在用OHT激活GPER后发生磷酸化。其他面板显示了ERK2的总水平,以及转染SkBr3细胞中内源性GPER和外源性FLAG-GPER的水平。用载体(-)或10μM OHT处理转染的SkBr3细胞30分钟。右边的面板显示了标准化为ERK2表达水平的印迹的密度定量;每个条形代表两个独立实验的平均值,顶部的线条表示两个值的范围;黑点表示任意设置为100%的样本,相对于该样本组中其他样本的值进行计算。B类GPER被招募到其靶基因的启动子c-FOS公司CTGF公司用CAFs_I和SkBr3细胞进行抗GPER抗体的ChIP检测。C类.衣霉素治疗诱导其靶基因启动子在SkBr3细胞中的GPER募集,用5μg/ml衣霉素处理24小时,然后用抗GPER抗体进行ChIP实验。D类ChIP实验,用shRNA或shGPER构建体转染SkBr3细胞24小时,然后用5μg/ml膜霉素再处理24小时,以评估GPER向靶位点的募集。使用抗GPER抗体进行ChIP实验。E类.控制RT-PCR实验,以验证shGPER介导的击倒GPER公司mRNA转染48小时后。数值标准化为GAPDH公司表达,并表现为shGPER转染细胞相对于对照shRNA构建物转染细胞的折叠变化(平均值±SD)。F类ChIP实验,评估NLS缺陷GPER向靶位点的募集。在这种情况下,使用抗FLAG抗体进行ChIP。在ChIP实验中,来自c-FOS公司CTGF公司启动子通过实时PCR进行鉴定;浓缩量是相对于输入量进行计算的(在面板B中),并将未经处理的对照物标准化为1(在面板C、D和F中)。条形图显示了三个独立实验的平均值±SD。*,与各自未经处理(或shRNA)的对照相比,p值≤0.05;§,p值≤0.05,与相应的野生型GPER质粒进行比较(面板F)。
图7
图7。过表达核GPER P16L变体的CAF条件培养基诱导MDA-MB-231乳腺癌细胞迁移
A类用来自CAF的条件培养基(CM)处理的MDA-MB-231细胞进行Boyden室分析的代表性显微照片。用对照shRNA或shGPER构建物或GPER表达载体的P16L突变版本(FLAG GPER P16L)转染CAFs_I 24小时,然后用100 nM E2处理18小时。B类.面板中显示的Boyden室分析定量A类值表示10个随机字段中计数的迁移细胞数的平均值±SD。数据代表了用三份样品进行的两个独立实验。

类似文章

引用人

工具书类

    1. Torre LA、Bray F、Siegel RL、Ferlay J、Lorte-Tieunt J、Jemal A.2012年全球癌症统计。CA癌症临床杂志。2015;65:87–108.-公共医学
    1. Shah R,Rosso K,Nathanson SD。乳腺癌的发病机制、预防、诊断和治疗。世界临床肿瘤学杂志。2014;5:283–298.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. 堪萨斯州科拉赫市伯恩斯KA。雌激素受体与人类疾病:最新进展。毒理学档案。2012;86:1491–1504.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Osborne CK,Schiff R.乳腺癌内分泌抵抗的机制。2011年医学年鉴;62:233–247.-项目管理咨询公司-公共医学
    1. Prossnitz ER,Maggiolini M.通过GPR30的雌激素信号和基因表达机制。分子细胞内分泌。2009;308:32–38.-项目管理咨询公司-公共医学

MeSH术语