Voltage-Dependent Anion Channel 1 Interacts with Ribonucleoprotein Complexes To Enhance Infectious Bursal Disease Virus Polymerase Activity

doi:10.1128/JVI.00584-17

.2017年7月27日；91（16）：e00584-17。

doi:10.1128/JVI.00584-17。 2017年8月15日印刷。

电压依赖性阴离子通道1与核糖核蛋白复合物相互作用增强传染性法氏囊病病毒聚合酶活性

韩春燕^1 2, 曾向伟², 帅瑶^1 3, 李高¹, 张立洲¹, 齐晓乐¹, 段玉璐¹, 杨波（Bo Yang）^1 4, 玉龙高¹, 刘长军¹, 张燕平（Yanping Zhang）¹, 王永强⁵, 王晓梅⁵

附属公司

¹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽类传染病科，哈尔滨，中国。
²东北林业大学，哈尔滨，中国。
³东北农业大学，哈尔滨，中国。
⁴中国荆州长江大学。
⁵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室鸟类传染病科，哈尔滨，中国yqw@hvri.ac.cn xmw@hvri.ac.cn。

PMID： 28592532
预防性维修识别码：项目编号：C5533923
内政部： 10.1128/JVI.00584-17

电压依赖性阴离子通道1与核糖核蛋白复合物相互作用增强传染性法氏囊病病毒聚合酶活性

韩春燕等。 J维罗尔. 2017.

.2017年7月27日；91（16）：e00584-17。

doi:10.1128/JVI.00584-17。 2017年8月15日印刷。

作者

韩春燕^1 2, 曾向伟², 帅瑶^1 3, 李高¹, 张立洲¹, 齐晓乐¹, 段玉露¹, 杨波（Bo Yang）^1 4, 玉龙高¹, 刘长军¹, 张燕平（Yanping Zhang）¹, 王永强⁵, 王晓梅⁵

附属公司

¹中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽类传染病科，哈尔滨，中国。
²东北林业大学，哈尔滨，中国。
³东北农业大学，哈尔滨，中国。
⁴中国荆州长江大学。
⁵中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室鸟类传染病科，哈尔滨，中国yqw@hvri.ac.cn xmw@hvri.ac.cn。

PMID： 28592532
预防性维修识别码：项目编号：C5533923
内政部： 10.1128/JVI.00584-17

摘要

传染性法氏囊病病毒（IBDV）是一种双链RNA（dsRNA）病毒。A段包含两个重叠的开放阅读框（ORF），编码病毒蛋白VP2、VP3、VP4和VP5。B段包含一个ORF并编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶VP1。IBDV核糖核蛋白复合物由VP1、VP3和dsRNA组成，在病毒生命周期中介导病毒复制和转录起着关键作用。在本研究中，我们确定了一种细胞因子VDAC1，该因子在IBDV感染期间上调，并发现可介导IBDV聚合酶活性。VDAC1通过与病毒蛋白VP1和VP3相互作用来感知IBDV感染。这种联系是由RNA桥接引起的，所有三种蛋白质都位于细胞质中。此外，小干扰RNA（siRNA）介导的VDAC1型导致病毒聚合酶活性降低，随后病毒产量降低。此外，VDAC1的过度表达增强了IBDV聚合酶活性。我们还发现病毒蛋白VP3可以取代A段来执行聚合酶活性。先前的一项研究表明，VP3 C末端的突变直接影响VP1-VP3复合物的形成。我们的免疫沉淀实验表明，VDAC1和VP3之间以及VDAC1与VP1之间的蛋白质相互作用在稳定VP3和VP1之间相互作用方面发挥了作用，进一步促进了IBDV聚合酶活性。重要性细胞因子VDAC1控制线粒体代谢物的进入和退出，并通过介导许多凋亡分子的释放在固有凋亡过程中发挥关键作用。在这里，我们确定了VDAC1的一个新作用，表明VDAC1与IBDV核糖核蛋白（RNP）相互作用，并通过稳定RNP复合物中的相互作用增强IBDV聚合酶活性，促进IBDV复制。据我们所知，这是VDAC1特异性参与调节IBDV RNA聚合酶活性的首次报道，为病毒与宿主的相互作用提供了新的见解。

关键词：IBDV；聚合酶活性；病毒复制。

PubMed免责声明

数字

图1
IBDV感染上调VDAC1的表达。（A） IBDV感染导致DF-1细胞中VDAC1表达上调。DF-1细胞被模拟感染或感染IBDV，MOI为1。在感染后12、24和36小时（p.i.）采集细胞，然后用抗VDAC1和-VP3抗体进行Western印迹分析。（B） DF-1细胞中VDAC1的相对强度。β-肌动蛋白被用作蛋白质负荷对照。显示了具有代表性的结果，条形图表示VDAC1/actin的强度，并将其归一化为控制条件。（C） IBDV感染导致*VDAC1型*DF-1细胞中的mRNA表达。DF-1细胞被模拟感染或感染IBDV，MOI为1。在感染后24和36小时收获细胞，然后通过qRT-PCR进行分析。（D） IBDV感染导致293T细胞中VDAC1表达上调。293T细胞被感染，并按A组所述进行分析。（E）293T淋巴细胞中VDAC1的相对强度。β-肌动蛋白作为蛋白质负载对照。显示了具有代表性的结果，条形图表示VDAC1/actin的强度，并将其归一化为控制条件。数据是三个独立实验的平均值和SD。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ****,*P（P）*<0.0001与对照组（未配对t吨测试）。

图2
击倒*VDAC1型*抑制IBDV的复制。（A） VDAC1 RNAi对内源性VDAC1表达的影响。用siRNA（RNAi#1、RNAi#2或RNAi#3）或干扰siRNA（Sc.）转染DF-1细胞。第二次转染48小时后收集细胞裂解物，并用抗VDAC1抗体进行Western blotting检测。内源性β-actin表达被用作内部对照。（B）敲低细胞中VDAC1的相对强度。β-肌动蛋白作为蛋白质负载对照。显示了具有代表性的结果，条形图表示VDAC1/actin的强度，并将其归一化为控制条件。（C和D）加扰RNAi细胞和*VDAC1型*RNAi细胞在MOI为1时感染IBDV。在IBDV感染后的不同时间点（12、24和36小时），用TCID测定细胞培养物（C）或上清液（D）中的感染性病毒载量₅₀使用96块钢板进行分析。（E）干扰RNAi细胞和*VDAC1型*按照面板C和D的描述感染RNAi细胞。在感染后12和24小时采集细胞，并用VP1、pVP2、VP3和VP5抗体进行Western印迹检测。内源性β-actin表达被用作内部对照。（F至I）病毒蛋白VP5（F）、VP3（G）、pVP2（H）和VP1（I）的相对强度*VDAC1型*siRNA处理的细胞。（J至L）控制RNAi细胞和*VDAC1型*按照面板C和D的描述感染RNAi细胞。在感染后12和24小时采集细胞，并通过qRT-PCR测定VP5（J）、pVP2（K）和VP1（L）的RNA水平。数据是三个独立实验的平均值和SD。*，*P（P）*< 0.05; **,*P（P）*< 0.01; ***,*P（P）*< 0.001; ****,*P（P）*<0.0001与对照组（双向方差分析）。

图3
VDAC1与病毒蛋白VP1和VP3相互作用，但不与VP5相互作用。（A）用VP5和VDAC1表达质粒转染293T细胞。转染48 h后制备细胞裂解物，用抗HA抗体免疫沉淀（IP），用抗FLAG或抗HA抗体进行免疫印迹。（B）如A组所述，转染293T细胞。转染后48 h制备细胞裂解物，用抗VDAC1抗体免疫沉淀，用抗FLAG或抗HA抗体免疫印迹。（C）用VP1和VDAC1表达质粒转染293T细胞。转染48 h后制备细胞裂解物，用抗Myc抗体免疫沉淀，用抗FLAG或抗Myc的抗体免疫印迹。（D）如C组所述，转染293T细胞。转染后48 h制备细胞裂解物，用抗VDAC1抗体免疫沉淀，用抗FLAG或抗Myc抗体免疫印迹。（E）用VP3和VDAC1表达质粒转染293T细胞。转染48 h后制备细胞裂解物，用抗HA抗体免疫沉淀，用抗FLAG或抗HA抗体进行免疫印迹。（F）如面板E所述，转染293T细胞。转染后48 h制备细胞裂解物，用抗VDAC1抗体免疫沉淀，用抗FLAG或抗HA抗体免疫印迹。（G）用VP3和/或VDAC1转染DF-1细胞24小时，然后固定并处理以进行双重标记。细胞核用DAPI（蓝色）复染。VP3（绿色）和VDAC1（红色）蛋白分别用单克隆抗HA和多克隆抗VDAC1抗体进行免疫染色，并用共焦显微镜进行分析。棒材，10μm。（a至d）VDAC1的位置；（e至h）VP3的位置；（i至l）VP3和VDAC1的位置。VP3染色为绿色，VDAC1染色为红色；合并图像中的共定位区域以黄色显示。（H）用VP1和/或VDAC1转染DF-1细胞24小时，然后固定并处理以进行双重标记。细胞核用DAPI（蓝色）复染。VP1（绿色）和VDAC1（红色）蛋白分别用单克隆抗Myc和多克隆抗VDAC1抗体进行免疫染色，并用共聚焦显微镜进行分析。棒材，10μm。（a至d）VDAC1的位置；（e至h）VP1的位置；（i至l）VP1和VDAC1的位置。VP1染色为绿色，VDAC1染色为红色；合并图像中的共定位区域以黄色显示。（一）编码全长VP3蛋白和截短VP3分子的基因示意图（CΔ30、CΔ100和NΔ100）。“Δ”后的数字表示从VP3的C末端或N末端删除的氨基酸的数量。（J） VDAC1和截短VP3蛋白之间的相互作用。我们用全长的HA-VP3或截短的HA-VP2分子转染293T细胞。转染48 h后制备细胞裂解物，用抗HA抗体免疫沉淀，用抗FLAG或抗HA抗体进行免疫印迹。

图4
RNA桥接VDAC1和IBDV VP1-VP3复合物之间的相互作用。（A）用VP1和/或VDAC1表达质粒转染293T细胞。转染后48 h制备细胞裂解物，然后用RNase A和RNase T对VDAC1-VP1相关裂解物进行RNA消化₁在室温下保持1小时。未经处理的细胞作为对照。所有裂解物用于免疫沉淀（IP）。用抗Myc抗体进行IP，用抗FLAG或抗Myc的抗体对裂解产物进行免疫印迹。（B）用VP3和/或VDAC1表达质粒转染293T细胞，并用RNase A和RNase T对VDAC1-VP3共转染混合物的裂解物进行RNA消化₁在室温下保持1小时。未经处理的细胞作为对照。所有裂解物用于免疫沉淀（IP）。用抗HA抗体进行IP，并用抗FLAG或抗HA抗体免疫印迹裂解物。（C）通过1%琼脂糖凝胶电泳分析每个样品的一部分的RNA含量。通道：−，未经RNA消化的样品；+，RNA消化样品。

图5
VDAC1增强IBDV聚合酶活性*在体外*（A和B）对表达IBDV片段B驱动荧光素酶微基因组系统（包括片段A、片段B、TK和VDAC1或空载体）的293T细胞进行聚合酶活性测定。通过Western blotting分析VDAC1、VP1和VP3蛋白表达。（C和D）聚合酶活性测定按面板A和B所述进行，但用VP3代替片段A。通过Western blotting分析VDAC1、VP1和VP3蛋白表达。内源性β-actin表达被用作内部对照。（E）的影响*VDAC1型*RNAi对内源性VDAC1。用特异性siRNA（RNAi#1、RNAi#2或RNAi#3）或对照转染293T细胞。第二次转染48小时后收集细胞裂解物，并用抗VDAC1抗体进行Western blotting检测。内源性β-actin表达被用作内部对照。（F） VDAC1的相对强度*VDAC1型*siRNA处理的细胞。β-肌动蛋白被用作蛋白质负荷对照。显示了具有代表性的结果，条形图表示VDAC1/actin带的强度，并将其归一化为控制条件。（G和H）293T细胞转染加扰对照或*VDAC1型*小干扰RNA。如面板C和D所述，转染36 h后进行聚合酶活性测定。通过Western blotting分析VDAC1、VP1和VP3蛋白表达。内源性β-actin表达被用作内部对照。

图6
VDAC1表达通过稳定VP1和VP3之间的相互作用增强IBDV聚合酶功能。（A） 293T细胞转染加扰对照或*VDAC1型*小干扰RNA。36小时后将VP1和VP3转染细胞。转染后36 h制备细胞裂解物，用抗Myc抗体免疫沉淀，用抗-Myc、抗-VDAC1或抗-HA抗体免疫印迹。（B） VP3的相对强度*VDAC1型*siRNA处理的细胞。β-肌动蛋白被用作蛋白质负荷对照。显示了具有代表性的结果，条形图表示VP3/actin带的强度，并将其归一化为对照条件。（C）如图A所述转染293T细胞。制备细胞裂解物，用抗HA抗体免疫沉淀，并用抗Myc、抗VDAC1或抗HA抗体免疫印迹。（D） VP1的相对强度*VDAC1型*siRNA处理的细胞。β-肌动蛋白被用作蛋白质负荷对照。显示了具有代表性的结果，条形图表示标准化为对照条件的VP1/肌动蛋白带的强度。数据是三个独立实验的平均值和SD。*，*P（P）*< 0.05; ****,*P（P）*<0.0001与对照组（未配对t吨测试）。

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1. Kibenge FS，Dhillon AS，Russell RG公司。传染性法氏囊病病毒的生物化学和免疫学。《维罗将军杂志》69:1757–1775。doi:10.1099/0022-1317-69-8-1757。-内政部-公共医学
1. Muller H，Scholtissek C，Becht H，1979年。传染性法氏囊病病毒的基因组由两段双链RNA组成。病毒杂志31:584–589。-项目管理咨询公司-公共医学
1. Hudson PJ，McKern NM，Power BE，Azad AA，1986年。传染性法氏囊病病毒大RNA片段的基因组结构。核酸研究14:5001–5012。doi:10.1093/nar/14.12.5001。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学
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1. von Einem UI、Gorbalenya AE、Schirmeier H、Behrens SE、Letzel T、Mundt E.，2004年。传染性法氏囊病病毒VP1是一种RNA依赖的RNA聚合酶。《维罗尔将军》85:2221–2229。doi:10.1099/vir.0.19772-0。-内政部-公共医学

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[1] Kibenge FS，Dhillon AS，Russell RG公司。传染性法氏囊病病毒的生物化学和免疫学。《维罗将军杂志》69:1757–1775。doi:10.1099/0022-1317-69-8-1757。-内政部-公共医学

[2] Kibenge FS，Dhillon AS，Russell RG公司。传染性法氏囊病病毒的生物化学和免疫学。《维罗将军杂志》69:1757–1775。doi:10.1099/0022-1317-69-8-1757。-内政部-公共医学

[3] Muller H，Scholtissek C，Becht H，1979年。传染性法氏囊病病毒的基因组由两段双链RNA组成。病毒杂志31:584–589。-项目管理咨询公司-公共医学

[4] Muller H，Scholtissek C，Becht H，1979年。传染性法氏囊病病毒的基因组由两段双链RNA组成。病毒杂志31:584–589。-项目管理咨询公司-公共医学

[5] Hudson PJ，McKern NM，Power BE，Azad AA，1986年。传染性法氏囊病病毒大RNA片段的基因组结构。核酸研究14:5001–5012。doi:10.1093/nar/14.12.5001。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[6] Hudson PJ，McKern NM，Power BE，Azad AA，1986年。传染性法氏囊病病毒大RNA片段的基因组结构。核酸研究14:5001–5012。doi:10.1093/nar/14.12.5001。-内政部-项目管理咨询公司-公共医学

[7] 阿扎德AA、贾加迪什MN、布朗MA、哈德逊PJ。双病毒大基因组片段的缺失定位和在大肠杆菌中的表达。病毒学161:145–152。doi:10.1016/0042-6822（87）90180-2。-内政部-公共医学

[8] 阿扎德AA、贾加迪什MN、布朗MA、哈德逊PJ。双病毒大基因组片段的缺失定位和在大肠杆菌中的表达。病毒学161:145–152。doi:10.1016/0042-6822（87）90180-2。-内政部-公共医学

[9] von Einem UI、Gorbalenya AE、Schirmeier H、Behrens SE、Letzel T、Mundt E.，2004年。传染性法氏囊病病毒VP1是一种RNA依赖的RNA聚合酶。《维罗尔将军》85:2221–2229。doi:10.1099/vir.0.19772-0。-内政部-公共医学

[10] von Einem UI、Gorbalenya AE、Schirmeier H、Behrens SE、Letzel T、Mundt E.，2004年。传染性法氏囊病病毒VP1是一种RNA依赖的RNA聚合酶。《维罗尔将军》85:2221–2229。doi:10.1099/vir.0.19772-0。-内政部-公共医学

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