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.2017年8月；9(8):1088-1099.
doi:10.15252/emmm.201707561。

γ-分泌酶失活导致底物积累和非阿尔茨海默病神经退行性变

Hermien Acx公司 1 2, Lutgard Serneels公司 1 2, 恩里科·拉达尔利 1 2, 谢尔盖·缪尔德曼 三, 塞西尔·文克 三, Elise Pepermans公司 1 2, 乌尔里克·穆勒 4, 卢西亚·查韦斯·古铁雷斯 5 2, 巴特·德·斯特罗珀 5 2 6
附属公司

γ-分泌酶失活导致底物积累和非阿尔茨海默病神经退行性变

Hermien Acx公司等。 EMBO分子医学. 2017年8月.

摘要

γ-分泌酶是一个膜内裂解天冬氨酰蛋白酶家族，是阿尔茨海默病的重要药物靶点。在这里，我们通过删除三个前咽部缺陷1，产生了出生后前脑锥体神经元中所有γ分泌酶缺失的小鼠(4月1日)亚单位(Aph1abc cKO Cre公司+). 小鼠表现出进行性皮层萎缩、神经元丢失和胶质增生。有趣的是，这与App、Aplp1、Nrg1和Dcc的膜结合片段的10倍以上积累有关，而其他已知的γ-分泌酶底物，如Aplp2、Lrp1和Sdc3的积累程度较小。尽管有许多报道将神经退行性变与膜结合App片段的积累联系起来4月1日敲除并不能拯救这种表型。重要的是，仅敲除Aph1a-或Aph1bc-分泌酶会导致底物的有限和差异积累。这与神经退行性变无关。应考虑进一步开发选择性Aph1-γ-分泌酶抑制剂来治疗阿尔茨海默病。

关键词：阿尔茨海默病；Aph1亚基；选择性抑制；副作用；γ‐分泌酶。

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数字

图EV1
图EV1。实验中使用的不同小鼠品系皮质裂解物的Western blot分析
六种野生型、六种Aph1abc cKO Cre公司 −，六个Aph1abc cKO Cre公司 +，六个Aph1a cKO Cre公司 −，六个Aph1a cKO Cre公司 +，六个Aph1bc cKO Cre公司 −、和六个Aph1bc cKO Cre公司 +使用针对Nct、Pen-2、Aph1a、Aphlbc、Psen1-NTF和App C末端的抗体通过免疫印迹法对小鼠进行分析。每个基因型显示两个样本。星号表示非特定波段。
图EV2
图EV2。只有CaMKIIa神经元中Aph1亚单位的完全缺失才能导致复杂结构的减少和APP处理的受损

  1. 野生型皮质裂解物，Aph1abc cKO Cre公司 −、和Aph1abc cKO Cre公司 +使用Nct、Pen‐2和Psen1 NTF抗体进行免疫印迹分析。蛋白质水平用β-actin标准化，并归一化为野生型。平均值、SEM和P（P）显示了每个基因型6只动物的值。野生型和野生型之间的蛋白质表达差异Aph1abc cKO Cre公司 −或Aph1abc cKO Cre公司 +使用每个蛋白质的单向方差分析计算，然后使用FDRP（P）Dunnett的价值调整事后（post-hoc）测试。

  2. 野生型皮质裂解物，Aph1abc cKO Cre公司 −、和Aph1abc cKO Cre公司 +使用App C末端抗体进行免疫印迹分析。蛋白质水平被量化，FL/CTF比率被标绘为野生型对照。平均值、SEM和P（P）显示了每个基因型六只动物的值。每个蛋白质的单向方差分析，然后是FDRP（P）价值调整P（P）‐从Dunnett的事后（post-hoc）测试。

  3. 七种野生型、七种Aph1abc cKO Cre公司 −、和七Aph1abc cKO Cre公司 +用AβELISA法对小鼠进行分析。Aβ水平归一化为野生型。平均值、SEM和P（P）显示了七只动物的值。每个蛋白质的单向方差分析，然后是FDRP（P）Dunnett的价值调整事后（post-hoc）测试。ns=无统计学意义。

可在线获取此图的源数据。
图1
图1。CaMKIIa表达神经元中γ分泌酶活性完全丧失导致神经退行性变

  1. 9月龄小鼠矢状脑切片的苏木精/伊红染色。上面板比例尺=1100μm；下面板比例尺=195μm。大脑皮层萎缩出现于Aph1abc cKO Cre公司 +小鼠，而在Aph1abc cKO Cre公司 −老鼠。

  2. 9月龄小鼠顶叶皮层的NeuN、Iba1和Gfap免疫荧光标记。比例尺=115μm。通过NeuN染色测定的NeuN阳性细胞的全皮层厚度计数在Aph1abc cKO Cre公司 +老鼠。通过Gfap和Iba1染色确定的反应性胶质增生存在于Aph1abc cKO Cre公司 +小鼠，而在Aph1abc cKO Cre公司 −老鼠。

数据信息：平均值、标准偏差和P（P）显示了值。单向方差分析和Dunnett’s事后（post-hoc）测试。CTX=皮层；cc=胼胝体；ns=无统计学意义。N个 = 3.
图EV3
图EV3。Aph1bc在成熟复合物的重建方面功能更为突出

  1. 六种野生型、六种Aph1a cKO Cre公司 +、和六个Aph1bc cKO Cre公司 +使用Nct、Pen-2和Psen1-NTF抗体对小鼠进行免疫印迹分析。蛋白质水平用β-actin标准化，并归一化为野生型。

  2. 六种野生型、六种Aph1a cKO Cre公司 +、和六个Aph1bc cKO Cre公司 +使用针对App C末端的抗体通过免疫印迹对小鼠进行分析。蛋白质水平被量化，FL/CTF比值被标绘为野生型对照。

  3. 七种野生型、七种Aph1a cKO Cre公司 +、和七Aph1bc cKO Cre公司 +用AβELISA法对小鼠进行分析。Aβ水平归一化为野生型。

数据信息：平均值、SEM和P（P）显示了值。每个蛋白质的单向方差分析，然后是FDRP（P）Dunnett的价值调整事后（post-hoc）测试。ns=无统计学意义。可在线获取此图的源数据。
图2
图2。在单个患者中未观察到神经退行性表型Aph1a型和Aph1bc cKO Cre公司 +老鼠

  1. 6月龄小鼠矢状脑切片的苏木精/伊红染色。比例尺=195μm。大脑皮层萎缩在Aph1a cKO Cre公司 +和Aph1bc cKO Cre公司 +大脑。

  2. 顶叶皮层的NeuN、Iba1和Gfap免疫荧光标记。比例尺=115μm。通过NeuN染色测定的NeuN阳性细胞的全皮层厚度计数在对照组中具有可比性，Aph1a cKO Cre公司 +、和Aph1bc cKO Cre公司 +老鼠。通过Gfap和Iba1染色确定的反应性胶质增生症在Aph1a cKO Cre公司 +和Aph1bc cKO Cre公司 +老鼠。

数据信息：显示平均值和标准偏差。单向方差分析和Dunnett’s事后（post-hoc）测试。ns=无统计学意义。N个 = 3.
图3
图3。底物的差异积累体内
使用针对不同γ分泌酶底物C末端的抗体通过免疫印迹分析海马裂解物。对于每个基底，显示了全长（FL）或80kDa呋喃裂解LRP碎片和C端碎片（CTF）。β‐肌动蛋白被用作负荷控制，以使数据正常化。分子量标记以kDa表示。

  1. 海马裂解物的Western blot分析Aph1abc cKO Cre公司 −和Aph1abc cKO Cre公司 +小鼠，显示了三个具有代表性的样本。每个基因型分析5只小鼠。

  2. 野生型海马裂解物的Western blot分析，Aph1a cKO Cre公司 + ,和Aph1bc cKO Cre公司 +，显示了三个具有代表性的样本。每个基因型分析10只小鼠。

  3. 对面板（A）中的FL和CTF蛋白水平进行量化，绘制FL/CTF比值，并将其标准化为Aph1abc cKO Cre公司 −控制。对照组和对照组之间的蛋白质表达存在显著差异Aph1abc cKO Cre公司 +使用Student’st吨测试每种蛋白质（GraphPad），然后是错误发现率（FDR）P（P）价值调整（R，3.3.1版），以纠正多重蛋白质测试。平均值、SEM和P（P）所示值，ns=无统计显著性，N个= 5.

  4. 对面板（B）中的FL和CTF蛋白水平进行量化，绘制FL/CTF比值，并将其归一化为野生型对照。野生型、，Aph1a cKO Cre公司 +、和Aph1bc cKO Cre公司 +使用每个蛋白质的单向方差分析计算，然后使用FDRP（P）Tukey的价值调整事后（post-hoc）测试。平均值、SEM和P（P）所示值，ns=无统计显著性，N个= 10.

可在线获取此图的源数据。
图4
图4。应用程序-CTF在Aph1abc cKO Cre公司 +大脑
用识别App C端部分的抗体进行免疫染色。矢状脑切片应用程序KO用小鼠显示抗体的特异性。有条件删除4月1日锥体神经元中的基因导致App‐CTF在海马和皮质区的突起中积聚。对海马齿状回（DG）和CA3区以及海马上覆的顶叶皮层的放大显示，App和App‐CTFs的表达主要局限于对照脑中的神经元胞体，而App‐CTFs则积聚在Aph1abc cKO Cre公司 +大脑。左侧面板的比例尺=390μm；中央面板的比例尺=150μm；右侧面板的比例尺=110μm。
图5
图5。应用程序消耗并不能挽救大脑皮层萎缩和神经胶质增生Aph1abc cKO Cre公司 +老鼠

  1. 9月龄小鼠矢状脑切片的苏木精/伊红染色。比例尺=195μm。进行性皮质萎缩在Aph1abc cKO Cre公司 +和Aph1abc cKO Cre公司 + × 应用程序KO小鼠，而对照组和应用程序KO老鼠。

  2. 顶叶皮层的NeuN、Iba1和Gfap免疫荧光标记。比例尺=115μm。通过NeuN染色测定的NeuN阳性细胞的全皮层厚度计数在对照组和应用程序KO小鼠，而在Aph1abc cKO Cre公司 +和Aph1abc cKO Cre公司 + × 应用程序KO老鼠。通过Gfap和Iba1染色确定的反应性胶质瘤在Aph1abc cKO Cre公司 +和Aph1abc cKO Cre公司 + × 应用程序KO小鼠，而对照组和应用程序KO老鼠。

数据信息：平均值、标准偏差和P（P）所示值，ns=无统计学意义。单向方差分析和Dunnett’s事后（post-hoc）测试。N个 = 3.
图EV4
图EV4。进展性神经退行性表型Aph1abc cKO Cre公司 +老鼠
3月龄、6月龄和9月龄小鼠矢状脑切片的苏木精/伊红染色。比例尺=195μm。皮质厚度的绝对数量标准化为Cre公司 −每个年龄段的室友。进行性皮质萎缩出现于Aph1abc cKO Cre公司 +老鼠。图1中还报道了9个月大小鼠的代表性图片。平均值、标准偏差和P（P）显示了值。双向方差分析和Tukey's事后（post-hoc）测试。CTX=皮层；cc=胼胝体，ns=无统计学意义。N个 = 3.
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