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.2017年8月；12(8):750-756.
doi:10.1038/nnano.2017.98。 Epub 2017年6月5日。

用纳米尺度操纵膜曲率探测活细胞内吞作用

赵文婷 1 2, 林赛·汉森 2, 新亚楼 2, 马修·阿卡马祖 三, Praveen D杂烩 2, 弗朗西丝卡·桑托罗 2, 杰西卡·马克斯 三, 亚历山大·格拉斯特 三, 大卫·G·德鲁宾 三, 易翠 1 4, 崔变晓 2
附属公司

用纳米尺度操纵膜曲率探测活细胞内吞作用

赵文婷等。 Nat纳米技术. 2017年8月.

摘要

氯氰菊酯介导的内吞作用（CME）涉及到质膜的纳米级弯曲和向内萌芽，细胞通过此调节膜蛋白的分布和细胞外物种的进入。广泛的研究表明CME蛋白可以主动调节质膜曲率。然而，尽管有研究表明，膜弯曲本身可以触发生化反应，但对质膜弯曲如何影响内吞蛋白活性的相互调节却很少有人探索。我们认识上的差距主要是由于精确控制活细胞膜曲率方面的技术挑战。在这项工作中，我们使用图案化纳米结构来产生明确的膜曲率，曲率半径从+50nm到-500nm不等。我们发现正弯曲的膜是CME的热点，关键的CME蛋白，网格蛋白和动态蛋白，对半径小于200 nm的正弯曲膜表现出强烈的偏好。在我们检测的10种CME相关蛋白中，都显示出对正弯曲膜的偏好。相反，其他膜相关蛋白和非CME内吞蛋白小窝蛋白1没有表现出这种曲率偏好。因此，纳米结构衬底构成了研究活细胞中曲率相关过程的新工具。

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作者声明没有竞争性的经济利益。

数字

图1
图1。垂直纳米柱产生明确的膜曲率，诱导内吞蛋白的局部积累
a。具有不同半径（灰色块）的纳米柱使细胞膜变形以产生不同的膜曲率（红线）的示意图。b。梯度纳米柱阵列的SEM图像，高度为700 nm，纳米柱之间的中心距为3µm，半径范围为500 nm（左）至50 nm（右），增量为14 nm。比例尺：10µm。底行：放大单个纳米柱的SEM图像，如顶行中相应位置所示（红色带箭头）。比例尺：400 nm。c。扫描电镜图像显示SK-MEL-2细胞在纳米柱上变形。比例尺：5µm。d。TEM图像显示细胞膜包裹在纳米柱周围。比例尺：100 nm。e、。CellMask™DeepRed染色的质膜显示纳米柱位置的膜信号增加。红色箭头表示不同半径的纳米柱的位置。比例尺：10µm。f、。包裹在纳米柱周围的质膜的TEM图像捕捉到了一个氯氰菊酯涂层的凹坑。比例尺：100 nm。g、。h中网格蛋白和动态蛋白2的免疫染色CLTA公司ZH/小时DNM2（DNM2）ZH细胞在纳米柱位置显示出氯氰菊酯和dynamic2的积累。在叠加图像中，反转的亮场图像被转换为蓝色（右下角）。比例尺：10µm。编号的黑色箭头表示具有不同半径的纳米柱的位置。小时。在32个不同半径的纳米柱上对网格蛋白、动态蛋白2和膜信号进行定量。对来自相同半径的许多纳米柱的信号进行平均，以获得平均图像。平均图像从最大半径（左上角）到最小半径（右下角）进行排序。从上到下显示了四个成像通道：亮场、网格蛋白、动态2和用于表面积增加的脂质双层控制。i、。网格蛋白RFP、dynamin2-GFP和脂质膜的强度都随着纳米柱半径的增加而增加（上图）。在对膜强度进行归一化后，很明显，当纳米柱半径小于200nm时，网格蛋白/膜和动力学2/膜的比率显著增加（下图）。每个数据点是90-191个纳米柱的平均值，误差条代表平均值的标准误差。详细统计分析见补充表S7。从平均小图像（补充图S6）计算的背景中也观察到类似的趋势，而不是使用中使用的滚动球算法我.j。动态2-GFP的4分钟电影的时间平均图像表明，动态2-GFP对锐利的纳米柱表现出强烈的偏好，但对同一细胞中的大半径纳米柱表现得更少（箭头1与.箭头3）。比例尺：10µm。
图2
图2。工程化3D纳米结构，用于多功能控制膜曲率和内吞蛋白积累
a。奈米棒和奈米棒设计的示意图，用于通过相同的纳米结构诱导从平面膜到高膜曲率（顶部，奈米棒）和组合正负膜曲率（底部，纳米C和纳米U）的范围。b。纳米棒阵列的SEM图像显示了150 nm宽、2µm长、1µm高和5µm间距的单个纳米棒（左侧，比例尺：2µm.）。c。当SK-MEL-2细胞在纳米棒阵列上培养时，CellMask™DeepRed染色显示，质膜均匀包裹在纳米棒周围。比例尺：2µm。d。4分钟电影的平均荧光图像显示，与侧壁相比，氯氰菊酯和dynamic2更喜欢纳米棒的两个高度弯曲的末端。这与c中显示的膜染色形成鲜明对比。在叠加图像中，纳米棒的亮场图像显示为蓝色。比例尺：5µm。e、。167个纳米棒上氯氰菊酯和动力学2分布的平均图像。比例尺：2µm。f、。以细胞溶质背景为参考，测定纳米棒末端和中心的荧光强度定量值。误差条表示平均值的标准误差。统计分析表明，纳米棒末端和纳米棒中心之间存在显著差异（未配对t检验的p值：氯菊酯RFP为0.0008，Dynamic2-GFP为0.0002）。g、。在两个相邻的纳米棒上的网格蛋白RFP（红色）和dynamin2-GFP（绿色）的Kymograph图显示网格蛋白片段末端附近出现dynamin2峰，这是网格蛋白介导的内吞作用的特征。在纳米棒的末端观察到动态事件，沿着侧壁或纳米棒之间几乎没有信号。补充图S11中显示了具有更多相邻纳米棒的更大区域上的更多波形图。小时。30°倾斜视图中的纳米CUI结构的SEM图像。比例尺：2µm。i、。纳米CUI阵列上细胞的CellMask™DeepRed染色显示，细胞膜包裹在纳米C和纳米U结构的内外表面。比例尺：2µm。j。4分钟电影的平均荧光图像显示，氯氰菊酯和dynamic2在纳米C和纳米U的末端和外表面上倾向于正膜曲率，而内表面上的蛋白质信号少得多。k、。51对nanoC和nanoU上的氯氰菊酯RFP（顶部）和Dynamin2-GFP（底部）的平均图像清楚地表明，与内表面相比，纳米C和纳米U的末端及其外表面上的优先堆积。比例尺：2µm。l、。定量荧光强度（ink个)最后是nanoC（左）和nanoU（右）的外表面和内表面，以细胞溶质背景为参考。误差条表示平均值的标准误差。统计分析显示端部/外表面存在显著差异与.纳米C和纳米U的内表面。图中显示了每对未配对t检验的p值。
图3
图3。利用纳米棒阵列探测不同内吞蛋白的曲率敏感性
a。与网格蛋白介导的内吞作用不同阶段相关的蛋白质示意图。高倍荧光图像b–o（b–o）（绿色图像，比例尺：2µm）显示了不同蛋白质在六个纳米棒上的分布。相应的大图像可以在补充信息中找到（图S9和S10）。数百个纳米棒的平均图像和沿着纳米棒长度的强度显示在荧光图像下方。CellMask™DeepRed染色质膜的空间分布(b)和膜相关蛋白mCherry-CAAX(c（c）)相对均匀地分布在纳米棒的整个长度上。与氯氰菊酯依赖性内吞有关的其他八种内吞成分，包括epsin1-GFP(如果)，两性激素1-YFP(克)，网格蛋白RFP(小时)，动态2-GFP(我)，AP2-GFP(j个)，相交(k个)，皮质素(我)和肌动蛋白(米)显示出对纳米棒末端的强烈偏向，沿侧壁的堆积很少。相比之下，FCHo1-GFP(e（电子）)，和转铁蛋白受体（TfnR-GFP）(如果)与上述相比，对纳米棒末端的偏好更低。另一方面，PH-GFP探测到PIP2(n个)和小窝蛋白1(o个)是小窝蛋白依赖性内吞作用的重要组成部分，均匀分布在整个纳米棒长度上。所有纳米棒的长度均为2µm。第页14种不同的蛋白质/染料在纳米棒上的分布通过纳米棒-烯与纳米棒-中心的归一化强度比进行量化。对于每种蛋白质，通过平均56-2072纳巴来测量其分布。误差条表示平均值的标准误差。每个蛋白质的统计显著性与CellMask通过未配对t检验和Welch校正进行评估（详情见补充表S8）。p值：****<0.0001，*<0.05，ns>0.05。
图4
图4。预弯曲膜是内吞作用的首选部位
a。dynamin2-GFP沿纳米柱线的Kymograph图显示，在纳米柱位置（线1和线3），dynamin2点重复出现和消失。沿着纳米柱之间的线绘制的类似波形图显示，dynamin2-GFP的信号非常小（线2和线4）。b。dynamin2-GFP点出现频率的空间映射显示了纳米柱位置的内吞热点。我们在6分钟内测量了75个纳米柱上的65个动态闪烁事件。纳米柱面积计算为1µm2每个。从同一组电影中，我们在75个平面区域（8µm）上测量了62个动态闪烁事件2每个。根据计算的膜面积进行标准化后，弯曲膜上纳米柱处的内吞事件发生率显著高于平坦膜上的内吞。误差条表示平均值的标准误差，Kolmogorov–Smirnov检验的P值<0.0001。c。氯氰菊酯RFP（上）和dynamin2-GFP（下）在纳米柱（蓝色）和平坦区域（红色）上的寿命分布。对于氯氰菊酯，在纳米柱上测量了226个事件，在平坦区域测量了154个事件。对于dynamic2，在纳米柱上测量了147个事件，在平坦区域测量了260个事件。对于纳米柱和平板之间的比较，Kolmogorov–Smirnov测试得出dynamin2-GFP的p值为0.0082，而clathrin-RFP的p值小于0.0001。差异是显著的。d。与平坦区域（深灰色）相比，纳米柱（浅灰色）上的氯氰菊酯RFP和dynamin2-GFP的平均寿命似乎有所降低。具有相同SD的非配对t检验给出了动态2 GFP的p值0.0004，网格蛋白RFP的p值<0.0001。差异是显著的。
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