DNA Polymerase Beta Participates in Mitochondrial DNA Repair

doi:10.1128/MCB.00237-17

.2017年7月28日；37（16）：e00237-17。

doi:10.1128/MCB.00237-17。 2017年8月15日印刷。

DNA聚合酶β参与线粒体DNA修复

附属公司

¹美国马里兰州巴尔的摩国家老龄研究所分子老年学实验室，校内研究计划。
²美国阿拉巴马州莫比尔市南阿拉巴马大学米切尔癌症研究所肿瘤科学系。
^三日本仙台东北大学发育、衰老与癌症研究所癌症与衰老动态蛋白质组研究室。
⁴丹麦哥本哈根哥本哈根大学健康老龄化中心。
⁵巴西圣保罗大学里贝拉奥·普雷托医学院遗传学系。
⁶美国马里兰州巴尔的摩国家老龄研究所遗传实验室，室内研究计划。
⁷美国马里兰州巴尔的摩国家老龄研究所分子老年学实验室，校内研究计划BohrV@grc.nia.nih.gov。

PMID： 28559431
预防性维修识别码：项目编号：C5533889
内政部： 10.1128/MCB.00237-17

DNA聚合酶β参与线粒体DNA修复

P西科拉等。分子细胞生物学. 2017.

.2017年7月28日；37（16）：e00237-17。

doi:10.1128/MCB.00237-17。 2017年8月15日印刷。

作者

P西科拉^1 2, S卡诺^三, M阿克巴里⁴, T库利科维奇¹, B A浸礼会¹, G S莱安德罗^1 5, H路¹, 田俊杰¹, A五月¹, K A贝克尔⁶, D L克罗托¹, D M Wilson第三¹, R W索波尔², A Yasui先生^三, V A玻尔⁷

附属公司

¹美国马里兰州巴尔的摩，美国国家老龄化研究所，室内研究项目，分子老年病学实验室。
²美国阿拉巴马州莫比尔市南阿拉巴马大学米切尔癌症研究所肿瘤科学系。
^三日本仙台东北大学发育、衰老与癌症研究所癌症与衰老动态蛋白质组研究室。
⁴丹麦哥本哈根哥本哈根大学健康老龄化中心。
⁵巴西圣保罗大学里贝拉奥·普雷托医学院遗传学系。
⁶美国马里兰州巴尔的摩国家老龄研究所遗传实验室，室内研究计划。
⁷美国马里兰州巴尔的摩国家老龄研究所分子老年学实验室，校内研究计划BohrV@grc.nia.nih.gov。

PMID： 28559431
预防性维修识别码：项目编号：C5533889
内政部： 10.1128/MCB.00237-17

摘要

我们在哺乳动物组织和细胞的线粒体蛋白提取物中检测到DNA聚合酶β（Polβ），它是一种关键的核碱切除修复（BER）蛋白。操纵N末端序列会影响线粒体中Polβ的数量。使用Polβ片段，可以鉴定线粒体特异性蛋白伴侣，这些相互作用物主要起到DNA维持和线粒体导入的作用。特别令人感兴趣的是TWINKLE、SSBP1和TFAM蛋白的鉴定，所有这些蛋白都是线粒体特异性DNA效应器，已知在核仁中起作用。Polβ与线粒体解旋酶TWINKLE在功能上直接相互作用。Polβ敲除（KO）的人肾细胞具有较高的内源性线粒体DNA（mtDNA）损伤。杂合Polβ小鼠组织和KO细胞的线粒体提取物具有较低的核苷酸掺入活性。小鼠来源的Polβnull成纤维细胞严重影响了代谢参数。事实上，Polβ基因敲除导致线粒体功能障碍，包括膜电位和线粒体含量降低。我们证明Polβ是一种线粒体聚合酶，参与线粒体DNA的维持，是线粒体稳态所必需的。

关键词：DNA聚合酶β；TFAM；基底切除修复；线粒体；线粒体DNA修复；线粒体健康；突变研究。

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数字

图1
线粒体中检测到DNA聚合酶β。（A）用增加的蛋白酶K消化从肝脏和大脑中纯化的小鼠线粒体，以去除外膜结合蛋白。肝脏样本（左）显示线粒体室中没有Polβ。脑（右）线粒体样本在蛋白酶消化后显示Polβ，证明Polβ位于线粒体膜内。VDAC1用作线粒体外膜标记物，并在0.5 mg/ml蛋白酶下消化。拉明A/C被用作核污染的标记。GAPDH显示了细胞质污染的程度。第二种抗体也用于验证结果[Polβ（Rb）]。装载了50微克蛋白质。（B）肾脏制剂有一条清晰的Polβ带。用人肾细胞（HEK293T）检测人细胞线粒体中是否存在Polβ，以及其水平是否可以人为控制。载体控制HEK293T制剂中存在可见量的内源性Polβ。Polβ的过度表达导致线粒体Polβ水平升高。TFAM线粒体控制抗体仅检测到人类形式的蛋白质。（C）为了验证Polβ抗体的特异性，使用CRISPR/cas9对HEK293T细胞进行Polβ敲除修饰。最左边的车道显示纯化Polβ蛋白的分子量。克隆23和24的总细胞蛋白提取物没有残留Polβ。红线表示分子质量标记为39 kDa。（D） HEK293T/Polβ-KO细胞的线粒体提取物与亲代和亲代+Cas9细胞的比较。将提取物暴露于0.05或0.1 mg/ml蛋白酶K或进行处理（NT）。在亲本细胞系的提取物中检测到Polβ，但Polβ-KO细胞系（克隆23和24）中没有Polβ。红线表示39和52 kDa的分子质量标记。（E）为了观察线粒体中的Polβ，用C末端GFP或FLAG全长（FL）Polβ转染HEK293T细胞，这是一种具有来自线粒体蛋白SOD2的MLS序列的阳性对照，以及具有17aa N末端缺失（D17N）的FL Polβ蛋白（完整描述见材料和方法）。（F）改良Polβ-GFP构建物的免疫印迹分析以验证蛋白质定位。样品1至4，线粒体提取物。样品5至8，全细胞裂解物。通道1和5，模拟转染细胞。FL Polβ-GFP第2和第6车道。3号和7号车道，SOD2 MLS–Polβ-GFP。D17N-Polβ-GFP第4和第8车道。VDAC1用于显示样品的线粒体富集。Tubulin被用作细胞质标记。1至4车道每车道含有10μg线粒体提取物，5至8车道每车道含2×10⁴每条车道的单元格数。（G）通过免疫荧光法在面板E中描绘了C末端FLAG结构的定位。线粒体（PDM通道）中检测到FL-Polβ-FLAG结构。SOD2 MLS信号的加入增强了PDM信号；然而，只有在17-aa N末端区域（D17N）缺失的情况下，细胞核定位才完全丧失，线粒体定位增强（另请参阅补充材料中的图S1G）。采用DAPI对细胞核进行可视化（放大倍率，×63，z叠加；比例尺=20μm）。

图2
Polβ的N末端与线粒体运输和线粒体DNA维持成分相互作用。（A）将过度表达Polβ的HEK293T细胞（参见补充材料中的图S2A至C）与GST标记的N端或C端Polβ重组片段一起孵育到谷胱甘肽-脑葡萄糖珠上。清洗后洗脱线粒体提取物中的结合蛋白（见图）。（B）用于后续质谱分析的凝胶银染色（也可参见表1和图S2D）。（C）用于质谱分析的GST下拉免疫印迹（IB）检测线粒体蛋白HSPA9和TFAM。还检测到线粒体导入蛋白TOM70和TIM50以及辅助线粒体DNA修复蛋白TWINKLE和POLDIP2。在所有情况下，线粒体蛋白仅与N末端Polβ片段结合。（D）纯化GST-TFAM片段以确定TFAM蛋白与线粒体Polβ结合的区域。（E）使用抗体检测鉴定GST-TFAM结合组分中的Polβ。Polβ与包含HMG1结构域的TFAM的N端片段结合。DNA维护蛋白POLDIP2、PARP1和OGG1也与HMG1片段结合。

图3
线粒体Polβ可以通过与线粒体DNA机械直接相互作用来调节线粒体DNA修复。（A）为了进一步验证质谱结果，用带有C末端FLAG的Polβ构建物瞬时转染HEK293T细胞。在FLAG免疫沉淀（IP）中检测到与TWINKLE蛋白的蛋白相互作用。（B）纯化的TWINKLE与纯化的Polβ在功能上相互作用，以增强蛋白链置换合成活性。（C）为了研究Polβ在线粒体修复中的作用，我们测量了圆形底物上的结合和连接活性（参见补充材料中的图S3A）。来自Polβ杂合子小鼠脑的提取物缺乏核苷酸掺入，但没有连接活性（24-mer）。泳道1，野生型线粒体提取物（30μg）。通道2，HT线粒体提取物（30μg）。在HEK293T细胞中Polβ的过度表达导致底物的结合和随后的连接增加。3巷，HEK293T载体控制线粒体提取物（15μg）。通道4，HEK293T加Polβ线粒体提取物（15μg）。（D） HEK293T线粒体提取物暴露于Polγ和连接酶抑制剂NEM。添加抑制剂后，合并带（标记为中间修复带）仍存在于车道2和4中。结扎也被完全抑制。通道1，HEK293T载体控制线粒体。通道2，HEK2903T载体线粒体加上5 mM NEM。3巷，HEK293T加PolβFLAG线粒体。4巷，HEK 293T+Polβ线粒体加5 mM NEM。Mito-WT有显著的（***，*P（P）*<0.001）比HT样品更高的掺入活性。HEK293T-plus-Polβ线粒体提取物显著增加（*，*P（P）*<0.01）与载体对照相比，在结合活性方面。蛋白质输入量为15μg。（E）在HEK293T线粒体中不存在Polβ的情况下，单核苷酸掺入活性降低。车道1和2，HEK293T，带cas9，带（+）或不带（−）NEM。通道3和4，HEK293T克隆23 PolβKO，带（+）或不带（−）NEM。通道5和6，HEK293T克隆24 PolβKO，带（+）或不带（−）NEM。与NEM处理的cas9提取物中的强健活性相比，NEM处理后PolβKO HEK293T细胞只有残留的线粒体单核苷酸插入活性。HEK293T PolβKO检测重复进行；所有其他分析均一式三份。

图4
Polβ减少导致内源性线粒体DNA损伤增加，突变率改变。（A） PolβKO不影响HEK293T细胞的集落形成能力。在所有组中，共有51000个细胞被电镀，电镀效率相似(n个= 6). 另请参见补充材料中的图S4A。（B）细胞暴露于CAP，线粒体核糖体基因突变可使细胞存活。在优化实验中10²到10⁵将细胞接种以确定HEK293T CAP敏感性。示例显示10⁴细胞板，cas9细胞中有数百个突变事件导致存活；相比之下，PolβKO细胞相对较少。（C）将镀层数量减少到500和1000，可以更准确地计数事件。细胞连续接触CAP 10天；与亲本加cas9相比，PolβKO克隆的存活率显著降低(n个=6，一式两份）。（D）来自亲代+Cas9细胞的mtDNA的扩增率比两个HEK293T Polβ缺陷系中的任何一个都高出约50%，这表明PolβKO细胞具有更高水平的内源性mtDNA损伤。试验一式三份。右图，凝胶图像显示无涂片的单一条带。图中还显示了作为输入控制的小片段PCR产物。（E） MitoTracker信号显示MEF-PolβKO细胞线粒体含量降低，线粒体网络破裂；下比例尺=40μm（放大倍数，×40）。（F）线粒体参数的测量表明，PolβKO MEF降低了线粒体含量和膜电位，但没有降低ROS水平(n个= 3; *,*P（P）*< 0.05; ***,*P（P）*< 0.005). （G） MEF-Polβ细胞的海马呼吸分析显示，正常化至基线后储备呼吸能力下降(n个=5）在Polβ空MEF细胞中。红线，PolβKO；绿线，WT。

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