The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory

doi:10.1101/gad.295907.117

.2017年5月1日；31(9):876-888.

doi:10.1101/gad.295907.117。 Epub 2017年5月25日。

核基质蛋白CIZ1促进Xist RNA定位到非活性X染色体区域

附属公司

¹约克大学生物系，约克YO10 5DD，英国。
²牛津大学生物化学系，牛津OX1 3QU，英国。
^三英国利兹LS2 9JT利兹大学利兹心血管和代谢医学研究所（LICAMM）。
⁴沙特阿拉伯王国利雅得努拉·宾特·阿卜杜拉赫曼公主大学（PNU）。
⁵英国剑桥大学干细胞研究所，剑桥CB2 1QR。
⁶利兹大学利兹分子医学研究所（LIMM），利兹LS9 7TF，英国。

PMID： 28546514
预防性维修识别码：项目编号：C5458755
内政部： 10.1101/gad.295907.117

核基质蛋白CIZ1促进Xist RNA定位到非活性X染色体区域

丽贝卡骑行（Rebeca Ridings-Figueroa）等。基因开发. 2017.

.2017年5月1日；31(9):876-888.

doi:10.1101/gad.295907.117。 Epub 2017年5月25日。

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¹约克大学生物系，约克YO10 5DD，英国。
²牛津大学生物化学系，牛津OX1 3QU，英国。
^三英国利兹LS2 9JT利兹大学利兹心血管和代谢医学研究所（LICAMM）。
⁴沙特阿拉伯王国利雅得努拉·宾特·阿卜杜拉赫曼公主大学（PNU）。
⁵英国剑桥大学干细胞研究所，剑桥CB2 1QR。
⁶利兹大学利兹分子医学研究所（LIMM），利兹LS9 7TF，英国。

PMID： 28546514
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内政部： 10.1101/gad.295907.117

摘要

核基质蛋白Cip1相互作用锌指蛋白1（CIZ1）与细胞周期蛋白一起促进DNA复制，并与成人和儿童癌症相关。在这里，我们发现CIZ1在小鼠和人类雌性细胞的非活性X染色体（Xi）上高度富集，并通过与RNA-依赖性核基质的相互作用而保留。CIZ1被招募到Xi，以响应X非活性特异转录物（Xist）的表达胚胎干细胞X失活早期的RNA依赖于CIZ1的C末端核基质锚定结构域和西斯特CIZ1-null小鼠虽然存活，但表现出完全渗透性的女性特异性淋巴增生性疾病。有趣的是，在来源于CIZ1缺失胚胎的小鼠胚胎成纤维细胞中，Xist RNA的定位被破坏，通过核质而不是局部高度分散。CIZ1重新表达后恢复焦点定位。从CIZ1-null动物分离的活化B和T细胞中，Xist RNA的局部定位也被破坏，这可能是女性特异性淋巴增生性疾病的一种解释。总之，这些发现表明CIZ1在锚定中起着重要作用西斯特特定体细胞谱系中的核基质。

关键词：CIZ1；X染色体失活；西斯特；淋巴增生性疾病；核基质。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
CIZ1在西安富集。(A类)CIZ1示意图，表示复制域（Copeland et al.2015），带有核定位信号（NLS，绿色）、功能性CDK磷酸化位点（粉红色）、RXL细胞周期蛋白结合基序（灰色）和NM锚定域（Ainscough et al.2007），带有C2H2型锌指（绿色）的位置，Matrin3型RNA结合锌指（Prosite PS50171）和酸性结构域（标记为E）。指出了N端和C端抗体识别的表位的位置。(B类)使用N端和C端抗体对野生型小鼠雌性PEF中的CIZ1（绿色）进行免疫检测。在H3K27me3染色的所有细胞中，观察到CIZ1和组蛋白H3K27me3（红色）的共定位为离散结构域。n个> 100. DNA用DAPI（蓝色）染色。其他单元格线如所示补充图S1; 有些有两个结构域，表明染色体重复。(C类)RNA-FISH西斯特（红色）在雌性PEF中显示与CIZ1蛋白（绿色）和Barr体（灰色）共定位。棒材，5µM。(D类)CIZ1对Xi的招募在区分XX种ESCs中与*西斯特*-介导H3K27me3沉积。d3和d9是停用LIF后的分化天数。其他时间点如所示补充图S1C. (E类)在有丝分裂期间分化的XX ESCs中的CIZ1和H3K27me3显示CIZ1在中期晚期减少，后期完全丢失，但H3K17me3保留。棒材，5µm。

**图2。**
CIZ1是Xi的RNA-dependent NM的一部分。(A类)单个C127I细胞核的最大强度投影SR 3D-SIM图像显示了相邻区域的*西斯特*焦点（绿色），CIZ1焦点（红色）位于Xi。个人示例Z几个单元格的部分如所示补充图S2. (B类)示意图显示了使用洗涤剂、高盐、DNase或RNase进行串行提取的方案，以揭示蛋白质–RNA NM部分或RNA-independent NM部分（仅蛋白质）。(C类)图像显示连续提取3T3细胞后的CIZ1（红色）。显示了具有离散CIZ1-Xi结构域的细胞比例(n个>100个），一些具有两个结构域，表明有一部分细胞是具有两个Xi的四倍体。PEF也获得了类似的结果(补充图S2C). DNA（蓝色）显示核酸酶处理的程度。对图像进行同样的修改，以便直接比较不同提取条件下的荧光强度。棒材，5µm。(D类)如中所示C类但之前使用DTSP进行蛋白质-蛋白质交联。(E类)显示NM中CIZ1两个种群的模型（蓝色）；RNA依赖性CIZ1与*西斯特*，RNA-independent CIZ1是核心NM的一部分。SAF-A（长谷川等人，2010）也与*西斯特*E重复，在RNA-dependent NM中用YY1表示。

**图3。**
描述*西斯特*和CIZ1域。(A类)短暂转染到循环野生型PEF 24小时后，招募所示GFP标记的CIZ1构建物（Coverley等人，2005年）。在Xi观察到核GFP转染细胞的比例(n个>100（每个构件），用代表性图像表示。对于GFP-C275，还显示了内源性CIZ1（红色），通过N-末端的表位检测。(B类)GFP-C275而非GFP-N572在Xi稳定表达的ESC系中的积累，这些ESC系也携带标记有结合BglG-mCherry融合蛋白的Bgl茎环的诱导性Xist RNA（Moindot等人，2015年）。几乎全部（61人中有58人）*西斯特*-mCherry表达细胞对GFP-C275呈阳性，而无(n个=47）GFP-N572阳性。(C类)诱导物示意图*西斯特*转染XY ESCs的构建物用于研究CIZ1招募。综述了CIZ1在转基因细胞系中的定位研究结果。(D类)显示缺少CIZ1与H3K27me3域共定位的示例图像(底部面板）或*西斯特*(顶部面板），ΔBsP西斯特构造缺少E重复。缺少*西斯特*D重复序列（ΔNS）不影响CIZ1的招募。所有转基因的数据如所示补充图S5.

**图4。**
X连锁基因的表达。(A类)散点图显示了三条野生型和三条CIZ1-完整PEF线的平均表达（对数₂所有表达的X连锁转录单位的FPKM（每千碱基每百万映射片段的片段数）。FPKM<0.99四舍五入为1。所有X连锁转录单位的平均表达为补充数据集S1. (B类)热图显示对数中的（白色到棕色）表达水平₂62个X连锁基因的FPKM在CIZ1-null PEF中发生显著变化。*P（P）*< 0.05. 基因按照X染色体示意图的顺序排列。未注释的转录本由XLOC基因ID号表示(补充数据集S1)、和预测的基因由前缀Gm表示。中列出了显著改变的转录单位补充数据集S2其中35个已注释，23个具有已知功能。(赖特)折叠变化显示34个下调（红色）和28个上调（绿色）转录单位分布在染色体上。(左侧X染色体示意图的）还显示了XIC处的基因的结果。(C类)六个X-连锁转录单位的表达，其中问<0.05，显示了三个野生型和三个CIZ1-null细胞系的平均FPKM，以及零衍生转基因初级PEF细胞系e13.17中CIZ1的再诱导作用。

**图5。**
CIZ1-null小鼠发育正常，但成年雌性小鼠表现出明显的淋巴异常。(A类)*Ciz1公司*^−/−胚胎在E15与野生型同窝卵难以区分。(B类,C类)的增长概况*Ciz1公司*^+/+(n个=5）和*Ciz1公司*^−/−(n个=8）出生后第20至160天的小鼠(B类)15至18个月大时*Ciz1公司*^+/+(n个=8）和*Ciz1公司*^−/−(n个=7）雌性(C类). 未检测到显著差异。然而，*Ciz1公司*^−/−雌性脾脏肿大(n个= 8Ciz1公司^+/+;n个= 6Ciz1公司^−/−)，肝脏(n个= 6Ciz1公司^+/+;n个= 4Ciz1公司^−/−)和肺部(n个= 5Ciz1公司^+/+;n个= 5Ciz1公司^−/−). 其他器官，包括肾脏和心脏，没有受到影响。(D类)脾脏粗大的典型图像*Ciz1公司*^−/−雌性，组织切片用苏木精和伊红染色（H&E）。淋巴细胞核（染色深）在*Ciz1公司*^+/+脾脏，但不是*Ciz1公司*^−/−脾脏。(赖特)高分辨率图像显示的形态学与淋巴增生性疾病一致*Ciz1公司*^−/−老鼠。(下面)CD20和CD3的免疫组织化学检测（分别为B细胞特异性和T细胞特异性）表明B细胞淋巴瘤伴有T细胞浸润。阳性细胞呈深灰色，呈重叠分布。棒材，200µm。(E类)代表性H&E染色*Ciz1公司*^+/+和*Ciz1公司*^−/−女性淋巴结、肝脏和肺部。继发性淋巴组织肿大*Ciz1公司*^−/−女性与淋巴细胞过度增殖有关，如D类. (赖特)中的大体组织解剖示例*Ciz1公司*^−/−女性表现为淋巴增生性疾病区域的苍白生长。棒材，200µm。

**图6。**
损失和恢复*西斯特*西安的本地化取决于CIZ1。(A类,左边)免疫-FISH显示CIZ1和Xist RNA，在CIZ1-null中去定位(*城市1*^−/−)产品环境足迹。DNA用DAPI（蓝色）染色。(下面)面积的量化*西斯特*FISH信号显示CIZ1-n全PEF细胞核平均分布在～40%以上，而野生型细胞的平均分布在<5%。(赖特)野生型和CIZ1-null细胞中的CIZ1和H3K27me3显示带有标记Xis的细胞比例。n个= 100. (B类)X染色体涂片在CIZ1-全型和野生型PEF中显示出类似的X染色体区域。(C类)双转基因雌性PEF来源于含有四环素反应的胚胎*Ciz1公司*CIZ1-全背景下的应答者转基因和反向反式激活剂转基因。(D类,E类)*Ciz1公司*转录本（引物Mm00503766_m1）(D类)和蛋白质（全细胞裂解物中的N末端抗体）(E类)在强力霉素诱导后检测到。(F类)用多西环素诱导24小时后，转基因表达的GFP-CIZ1在CIZ1-全背景下的代表性视野。注意在一些细胞中存在两个结构域，表明四倍体细胞中有两个Xi。棒材，10µm。(克)全长CIZ1在*城市1*^−/−产品环境足迹导致*西斯特*到西安领土。(*H（H）*)细胞比例的定量*西斯特*“分散”的FISH信号（定义为占据>10%的核区域）。CIZ1转基因诱导使CIZ1-null细胞在20小时内恢复到该标准的明显正常状态。

**图7。**
CIZ1调制*西斯特*脾细胞定位(A类)LPS或αCD3激活前后野生型脾细胞中CIZ1的定位。刺激导致在24小时内B和T淋巴细胞中Xi处的CIZ1积累。巴，10µm。(B类)LPS或αCD3激活前后脾细胞中的Xist RNA定位。与CIZ1类似，刺激会导致*西斯特*24小时内野生型B和T淋巴细胞的Xi，而Xist RNA没有正确定位在CIZ1-null细胞中。棒材，10µm。n个=每组200–300。

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[2] 安斯科夫·JF、拉赫曼·FA、塞尔科姆·H、塞多·A、格拉赫·B、科弗利·D·2007。C末端结构域将DNA复制因子Ciz1传递到核基质。细胞科学杂志120:115-124。-公共医学

[3] Bardelli M、Leucci E、Schurfeld K、Bellan C、Passiatore G、Rocchigiani M、Bartolommei S、Orlandini M、Zagursky J、Lazzi S等，2007年。VEGF-D在活化的淋巴细胞以及造血和淋巴组织的肿瘤中表达。白血病淋巴瘤48:2014–2021。-公共医学

[4] Bardelli M、Leucci E、Schurfeld K、Bellan C、Passiatore G、Rocchigiani M、Bartolommei S、Orlandini M、Zagursky J、Lazzi S等，2007年。VEGF-D在活化的淋巴细胞以及造血和淋巴组织的肿瘤中表达。白血病淋巴瘤48:2014–2021。-公共医学

[5] Bianchi I，Lleo A，Gershwin ME，Invernizzi P.2012。X染色体和免疫相关基因。《自动免疫杂志》38:J187–J192。-公共医学

[6] Bianchi I，Lleo A，Gershwin ME，Invernizzi P.2012。X染色体和免疫相关基因。《自动免疫杂志》38:J187–J192。-公共医学

[7] Brockdorff N、Ashworth A、Kay GF、McCabe VM、Norris DP、Cooper PJ、Swift S、Rastan S.1992年。小鼠Xist基因的产物是一个15 kb的非活性X特异转录物，不含保守的ORF，位于细胞核中。手机71:515–526。-公共医学

[8] Brockdorff N、Ashworth A、Kay GF、McCabe VM、Norris DP、Cooper PJ、Swift S、Rastan S.1992年。小鼠Xist基因的产物是一个15 kb的非活性X特异转录物，不含保守的ORF，位于细胞核中。手机71:515–526。-公共医学

[9] Brown CJ，Willard HF.1994年。维持X染色体失活不需要人类X失活中心。自然368:154-156。-公共医学

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